微衛星序列又稱簡單序列重復(Simple sequ?ence repeat, SSR) ， 是廣泛分布于真核生物基因組 中的高度重復序列。在動植物研究方面，目前己成 為遺傳連鎖分析、基因定位以及遺傳標記圖譜構建 等領域一個極為重要的研究手段[1，2]。典型的微衛星 DNA重復單位的核心序列為2~6 bp，重復次數為 10~20 次，長度一般為 100~300 bp。
聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide gel elec?trophoresis, PAGE) 技術由于其檢測靈敏和分辨率高 的特點，特別適合于小片段多態性擴増產物條帶的檢測，并且分離效果好，分辨率高。理論上，不同濃度馬鈴薯的凝膠在一定范圍內，凝膠的濃度越大，分辨 率越高，對長度差異片段區分性越好，越有利于基 因型的判斷。擴増片段檢測目前主要采用溴化乙錠 (Ethidium bromide, EB)染色與硝酸銀染色[3]。銀染 由于染色背景較深，非特異性條帶較多，品種之間 的特異性條帶不易區分，不利于進行品種純度方面 的鑒定分析[4];聚丙烯酰胺淬滅EB的熒光，使EB 染色的靈敏度降低，但是此方法操作時間短、程序 簡單、背景顏色淺、成像容易，使得SSR擴増的 多態性目的條帶帶型清晰，數量也能夠滿足實驗分 析要求。另外，EB染色結果具有一致性，重復性 好的優點，成為品種鑒定方法中條帶染色的首選方 法。
本試驗擬通過對聚丙烯酰胺凝膠電泳參數的分 析，確立馬鈴薯品種純度鑒定中標記產物的最佳電 泳體系，以滿足試驗分析的需要，同時為馬鈴薯主 栽品種DNA指紋圖譜的構建打下理論基礎。
1材料與方法1.1試驗材料本試驗選用的馬鈴薯為黑龍江省主栽品種，由 黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所提供(表 1)。
SSR標記所用引物序列由加拿大蒙特利爾麥吉 大學科研組提供(表2)，并由上海生工生物技術公 司合成；其它試劑(TaqDNA聚合酶等)均購自大連 寶生物試劑公司。
表1試驗用馬鈴薯品種序號品種名稱級別1早大白原原種2黃麻子原原種3克新13號原原種4荷蘭15原原種5大西洋原原種表2 SSR標記所用引物序列情況引物編號序列順序^到30SSI-FTCT CTT GAC ACG TGT CAC TGA AACSSI-RTCA CCG ATT ACA GTA GGC AAG AGAPatatin-FCAA CCA ACA AGG TAA ATG GTA CCPatatin-RTGG TCT GGT GCA TTA GAA AAA ASTM0014-FCAG TCT TCA GCC CAT AGGSTM0014-RTAA ACA ATG GTA GAC AAG ACA AAUGP-FGAA ACT GCT GCC GGT GCUGP-RTGG GGT TCC ATC AAA C電泳操作如上，比較不同電壓電泳結果的差異。
表3不同濃度聚丙烯酰胺凝膠的配制凝膠濃度5%8%12%16%30%丙烯酰胺儲液(ml)1.662.6645.25 X TBE (mD222210%過硫酸胺（APS) ([xL100100100100四甲基乙二胺(TEMED) (pH10101010雙蒸水(mL6.845.8442.8分離的DNA大小(bp)80~50060~40040~20020~1001.2試驗方法1.2.1馬鈴薯塊莖DNA提取米用Isolation buffer提取液提取馬鈴薯DNA， Isolation buffer 提取液配方如下：100 mM Tris (pH 8.0)，50 mM EDTA (pH 8.0)，1.3 M NaCl， 0.2%SDS，0.5% Triton X-100, 1% PVP， 10 mM DTT，60 mM b-mercapto ethanol，其它操作步驟同 一般SDS提取方法[5,6]，并用Alpha Innotech公司的 December 2006型紫外凝膠成像儀檢測結果。
1.2.2SSR 標記PCR反應體系(20 |xL):10xPCR 緩沖液 2 |xL，10 mM dNTPs 0.8 |xL， 25 mM MgCl2 2.4 |xL，Taq DNA 聚合酶(5 U /|xL) 0.15 ^L，4mM上游引物1 ^L，4mM下游引物1 |xL，滅菌雙蒸水11.65|xL，模板DNA60ng。
PCR擴増程序：95T：預變性 5 min; 94T：變性 30 s，48.5T：復 性45 s，72T：延伸90 s，共35個循環；72T：延伸 7 min，在 Biometre 公司 T-Gradient Thermoblock 型號PCR擴増儀上擴増，產物4丈保存。
PCR產物用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，EB染 色，紫外凝膠成像儀檢測結果。
1.2.3聚丙烯酰胺凝膠電泳參數分析(1)不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳比較分別配制5%、8%、12%、16%的聚丙烯酰 胺凝膠，所需各種試劑及用量如表3，預電泳 30 min 后，取 PCR 產物 5|xL 與 1|xL 6-Loading Buffer混勻，上樣，電泳，EB染色，紫外凝膠成 像儀檢測結果。
(2)電壓變化對電泳結果的影響設置電壓梯度為330V、250V、170V、90V，(3)凝膠染色方法比較①銀染方法：A.銀染液的配制：固定液（100 mL冰乙酸加水 稀釋至 1 000 mL);染色液（2g AgNO3、1.5 mL 37%甲醛，加水稀釋至1 000 mL ;顯色液（30 g Na2CO3、1.5 mL 37% 甲醛、0.2 mL Na2S2O3，加水 稀釋至1 000 mL ;終止液（10%冰乙酸。
B銀染法操作：固定30min—去離子水洗滌5~ 10 min—?染色30 min—?去離子水洗潘2次（每次不 超過30 s)—顯色至所要程度^終止顯影。
②溴化乙錠(EB)染色：將EB貯液（10 mg ‘mL-)用雙蒸水稀釋至 0.5 ^g’mL-1，將電泳后的凝膠放入染色液中30 min，染色后的凝膠放入蒸饋水中清洗5 min，再 將凝膠放入紫外凝膠成像儀觀測結果。
2結果與分析2.1 DNA提取結果將5個馬鈴薯品種提取的DNA，各取5 ^L， 與16-Loading Buffer混勻，用1%瓊脂糖凝膠，100 V電壓，電泳30 min，結果用紫外凝膠成像儀 檢測。從電泳結果可以看出，用Isolation buffer提 取液提取的馬鈴薯DNA，質量好，主帶唯一，無 拖尾和彌散，能夠滿足SSR標記的要求（圖11。
2.2不同參數電泳結果比較2.2.1不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠，凝膠的孔徑大 小、分辨率不同，分離效果也明顯不一樣（圖2)。 凝膠濃度較低時一5%，膠的分辨率明顯不好，SSR 標記擴増的多態性條帶數量少，帶型模糊，不利于 帶型區分、品種區分；12%和8%濃度的凝膠相比， 多態性條帶數量多，帶型清晰，品種之間的區分更 明顯；16%濃度的凝膠電泳，多態性條帶數量并沒 有較12%濃度的凝膠有明顯的増加，并且由于電泳 時間過長，單一條帶反而有些離散，不如12%濃 度的凝膠條帶集中、明亮，同時配制16%濃度的 凝膠所需要的相關試驗試劑的用量也比較大，試驗 成本也會相應増加。
3—12%濃度的 PAGE; 4—16%濃度的 PAGE。
(泳道對應的馬鈴薯品種順序與表1對應，M為標準分子質量2.2.2不同電壓下的電泳結果在實際電泳操作中，不同電壓下的電泳對應的 時間、電流參數如表4。
表4不同實際操作電壓下的時間、電流參數值電壓（V)工作參數電流(mA)時間(min)
330928025057150170462609026460在330V電壓下，電泳只需要80 min就能完 成，但是因為電泳速度過快，標記的多態性條帶不能完全分離開來，并且條帶不清悉；90 V電壓下， 電泳結果比較好，能夠滿足實驗分析的需要，但是 電泳時間太長，接近8個小時；250 V、170 V電 壓均能將泳道中的多態性條帶分開，滿足試驗分析 的需要，并且，170 V電壓電泳，多態性條帶更清 晰，可以采用（圖3)。
2.2.3PCR標記產物不同染色方法的結果比較 EB染色，多態性條帶清晰，背景淺，并且同 一品種多次擴増成像一致，便于實驗結果分析；銀 染法隨著時間的増長，背景逐漸加深，顯示的多態 性條帶數目増多，目的條帶相近的細小條帶(俗稱 影子帶）也在増多，若對目的條帶帶型不是很了 解，則不利于基因型的判斷，對多態性信息量、簡 單匹配系數等的試驗分析也容易出現錯誤。比較結 果如圖4。
1001234圖3不同電壓下的電泳結果1 一電壓為330 V; 2 —電壓為250 V;3—電壓為170V; 4—電壓為90V。
(泳道對應的馬鈴薯品種順序與表1對應，M為標準分子質量12 3 45M12345M12345M12345M12345M1000100010001 1500 爸；;500500- 500- 500P 500400— 400—400—400^400300— 300—300-300"300■ _ _ _ ■圖4SSR標記產物不同染色方法結果比較1—標記產物EB染色結果；2—銀染20 min結果；3—銀染30 min結果；4—銀染50 min結果；5—銀染70 min結果。
(泳道馬鈴薯品種順序與表1相同，M為標準分子質量3結果與討論SSR標記與其它標記方法（RFLP、RAPD、 AFLP等)相比，具有共顯性遺傳，符合孟德爾遺傳 規律，數量豐富，分布均勻，覆蓋整個基因組， 試驗重復性好，結果可靠性高等優點[7,8]，是馬鈴 薯品種純度鑒定分析的理想的分子標記。SSR標記 結合聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種常用的檢測方法， 聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨力極高，用于測序的聚 丙烯酰胺凝膠可分離相差1 bp的DNA片段，能 夠將品種特異性的譜帶分離出來，進而判定純度 和真實性。但是對凝膠結果影響因素較多，不同 的試驗處理對成像結果都有影響，影響大的以至 于不能進行試驗結果的分析，因此，需要對聚丙 烯酰胺凝膠電泳參數進行優化，聚丙烯酰胺凝膠的 濃度、電泳時間都是其中重要的參數，試驗結果表 明：在聚丙烯酰胺凝膠的濃度為12%、電泳電壓 為170V的情況下，PCR標記產物多態性條帶清晰、 明亮、穩定，便于試驗分析與交流。PCR擴増產 物經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，目標產物的檢測 主要采取顯色法。目前大多采用同位素放射自顯影 法、熒光染料標記法、EB染色法和銀染法，放射 自顯影法操作過程比較繁瑣，且操作者容易遭受同 位素照射的危險，在推廣應用中有一定的難度；熒 光染料標記法操作過程同樣繁瑣，試驗成本較高； 銀染法其檢測的靈敏度接近于同位素檢測，但是整 個銀染檢測操作步驟也非常繁鎖，染色花費的時間 也較長(染色1次約需要2 h)，同時，使用到的配 制試劑較多，試驗穩定性也難以控制，不利于品種 鑒定[9]; EB染色法方便易行，時間短，全程只需要 35 min操作比較簡單，只需要配置一種溶液，采 用兩個步驟，紫外凝膠成像儀成像方便，并且EB 染色結果穩定，利于試驗分析。但是EB具有致癌 性，對人身體健康有害，因此，找到一種更好的染 色方法，既有利于試驗分析，又不危害身體，對 SSR標記方面的研究是非常必要的。