聚丙烯酰胺凝膠電泳（英語： polyacrylamide gelelectrophoresis，簡稱PAGE） 作用：用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。

簡介

而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)最初由shapiro于1967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑（SDS即十二烷基硫酸鈉）后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小（可以忽略電荷因素）。[1]

2作用

SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，與連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。

濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCl緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCl解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動(dòng)，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。

此鑒定方法中，蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無關(guān)。

3補(bǔ)充信息

聚丙烯酰氨凝膠電泳

聚丙烯酰氨凝膠電泳

，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)聚合法和光聚合法。化學(xué)聚合以過硫酸銨（APS）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HCl。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HCl。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。

4過程

SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應(yīng)用于提純過程中純度的檢測，純化的蛋白質(zhì)通常在SDS電泳上應(yīng)只有一條帶，但如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會(huì)形成分別對應(yīng)于各個(gè)亞基的幾條帶。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質(zhì)，而且通過電泳還可以同時(shí)得到關(guān)于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設(shè)計(jì)提純過程都是非常重要的。

5常見問題

在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。

所以，pH對整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素，當(dāng)然其他的因素也可以從多方面考慮。

⒉ 樣品如何處理？

根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。

1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或β-巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。

2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。

3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。

⒊ SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；

制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.8，分離膠選擇pH8.8，選擇Tris－HCl系統(tǒng)，TEMED與AP：AP 催化劑，催化單丙和雙丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺，催凝劑，加速AP催化作用；十二烷基磺酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。

⒋ 提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊》P82-103。

⒌“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？

主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。

處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

⒍ “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？

主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。

處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。

⒎ 為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？

主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。

處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過長，重新配制；降低凝膠濃度。

⒏ 為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？

主要是樣品不溶性顆粒引起的。

處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。

⒐ 什么是“鬼帶”，如何處理？

“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。

處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

⒑ 為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？

我們在實(shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。

處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。

⒒ 為什么電泳的條帶很粗？

電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。

處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7）；適當(dāng)降低電壓；

⒓ 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？

這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。

處理辦法：電泳槽正確裝配即可。

⒔ 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？

這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對電泳不會(huì)有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。

⒕ 凝膠時(shí)間不對，或慢或快，怎么回事？

通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時(shí)膠太硬易裂，電泳時(shí)易燒膠。

⒖ 電泳時(shí)間比正常要長？

可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯(cuò)誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。

⒗分離膠加上后為什么要立即加水？

加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時(shí)在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。

⒘連續(xù)分離膠體系配制（凝膠板厚度0.75mm，長度10cm）100ml體系：雙蒸水37.5ml

尿 素20--50g

10×TBE緩沖液8ml

30%丙烯酰胺10ml

APS（過硫酸銨）500--800ul [注：現(xiàn)配現(xiàn)用]

TEMED（四甲基乙二胺） 23.5ul

6原理

2．制備凝膠時(shí)需要的原料是：丙烯酰胺，亞甲基雙丙烯酰胺（雙體，用作交聯(lián)劑）o在水溶液中用催化劑引發(fā)聚合。常用的催化劑有：二甲氨基丙腈（DMAPN）；過硫酸銨，四甲基乙二胺；過硫酸銨或加核黃素后用紫外光（波長253．7毫微米）引發(fā)聚合。

3．聚合時(shí)丙烯酰胺分子通過加成反應(yīng)形成長鏈，雙體的作用是在長鏈之間形成交聯(lián)，成為具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠（見圖1）。所以在凝膠電泳中除了具有電泳的分離外還具有分子篩作用，從而增高了它的分辨能力。

4．聚合時(shí)，根據(jù)分離的需要，可以用改變單體溶液濃度或增減雙體比例的辦法制成孔度大小不同的凝膠。在分離血清蛋白時(shí)，我們采用的丙烯酰胺總濃度為6．5%，內(nèi)含單體96%，雙休4 5{芻（T一6．5，c一4%）。

5．聚合物分子中含有很多酰胺基，所以凝膠具有良好的親水性，能在水中溶脹但不溶解。

7實(shí)驗(yàn)材料

編輯

一．設(shè)備

進(jìn)行凝膠電泳的裝置見圖版4。

1）直流電源如果一次進(jìn)行電泳的管數(shù)在20管以內(nèi)可以用最大電流300毫安的整流器（硅或硒整流器），調(diào)壓范圍0—300伏。

2）電泳裝置包括二個(gè)緩沖液槽和電泳 管。液槽可以用玻璃或塑料制成，在底部鉆孔。插入電泳管，用有孔橡皮塞固定。電泳管選用孔徑均勻一致的玻璃管切制。長10厘米，內(nèi)徑 ^5毫米。脫色用玻璃管長10厘米，內(nèi)徑8毫米。底部稍拉尖，用半透膜及橡皮圈套住底部。

3）凝膠管架灌裝凝膠管時(shí)使管保持垂直位置，用有機(jī)玻璃制成。

二．操作方法

1）凝膠管的制備將電泳玻管用小橡皮塞塞住底部，然后灌入新配的凝膠溶液（方法見下文）。每管加至液體高度為7．5厘米。為了保證凝膠表面平整可用注射器通過細(xì)針頭小心地加一層（高約1厘米）蒸餾水于表面上，勿使與凝膠液混合，室溫放置。如果條件合適溶液于 30—60分鐘內(nèi)聚合而成凝膠。凝膠溶液的配制方法如下：溶液甲：丙烯酰胺（氯仿重結(jié)晶）25克，雙體（甲醇重結(jié)晶）1克，加水配成100毫升溶液。必要時(shí)用三羥甲基氨基甲烷調(diào)pH至7．0。溶液乙：二甲氨基丙腈l毫升，三羥甲基氨基甲烷0．85克（也可用0．625克氨三乙醇或氨乙醇）加水至100毫升。溶液丙：K3Fe(cN)6分析純0．075克，加水至100毫升新配。用作阻聚劑以延緩凝聚時(shí)間。使操作方便，如凝聚時(shí)間已足夠長可以用蒸餾水代替。溶液丁：過硫酸銨（二級）2．8克加水至 100毫升新配。必要時(shí)用氨水調(diào)pH至7．0 c， 溶液甲及乙配后可在冰箱中保存數(shù)月。溶液丙及丁用時(shí)新配。臨用前將溶液甲、乙、丙、丁等量混合。

2）準(zhǔn)備把已灌裝凝膠的玻管通過有孔椽皮塞安裝在上面液槽的底孔中，在上下兩槽內(nèi)分別注入緩沖液。裝上后電泳管下端應(yīng)浸沒在下槽的緩沖液中，管下端勿留氣泡。血清電泳可以用巴比妥緩沖液pH一8．6，離子強(qiáng)度0．05（配法：巴比妥鈉10．3克，二乙基巴比土酸1．84克，加水至1升，溫?zé)崾谷堋＜恿蛄?．1克防霉）。

3）加樣在資料介紹的方法中，一般還在了這一步。在血清樣品中加入少量蔗糖以增加密度，用血紅蛋白吸管直接小心地加在凝膠表面上，加樣量一般為7微升血清。如果在樣品中混入少量溴酚蘭指示劑就可以在電泳過程中觀察前沿移動(dòng)的情況。

4）電泳在二液槽中安放鉑金絲電極；正極在下，負(fù)極在上。接通電源進(jìn)行電泳，電場強(qiáng)度10伏/厘米左右，視室溫高低而定。室溫較高時(shí)宜用較低的電壓以免發(fā)熱過度影響分離。蛋白質(zhì)向正極移動(dòng)。侍染料前沿移動(dòng)至管底近處，停止電流。電泳時(shí)間為1一2小時(shí)。電泳完畢取下凝膠管，用細(xì)長針頭沿管壁注蒸餾水，使凝膠與管壁剝開。然后用橡皮球壓出凝膠條。

5）染色及脫色電泳后的凝膠條在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染色1小時(shí)以上。染色后的凝膠條用7%醋酸洗滌數(shù)次。置于脫色玻管中，在同一電泳裝置中電解脫色。此時(shí)改用7%醋酸充裝在液槽中。通電后過剩凝膠之上再加一層大孔凝膠，樣品聚合在最后的另一層凝膠中（圖2）。在我們的試驗(yàn)中省略的染料泳向正極。脫色時(shí)電場強(qiáng)度25伏/厘米，電流10—1 5毫安/管。3—4小時(shí)脫色完畢。增高電壓可以加速脫色。有色的醋酸溶液通過盛有活性炭的漏斗過濾，即可除去染料，重新使用。

6）保存與記錄脫色后的凝膠可以裝在盛有7%醋酸的有塞試管中保存數(shù)年。也可以自然干燥后保存，在需要觀察時(shí)再浸在7%醋酸中溶脹成原來形狀。記錄可以用照相攝影。也可以用光密度計(jì)進(jìn)行捕記。光密度計(jì)的分辨力決定于其狹縫寬窄及光電管放大倍數(shù)。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1．電泳條件的選擇

為了選擇血清蛋白電泳較合適的條件，我們分別對單體濃度、雙體濃度、配制凝膠時(shí)所用不同正離子、各種電壓、二甲氨基丙腈的濃度、過硫酸銨的濃度等條件進(jìn)行了試驗(yàn)。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，我們在分離血清蛋白時(shí)選用的條件是：單體濃度6.25-6.5%，雙體占總丙烯酰胺量的4—5%，正離子采用三羥甲基氨基甲烷，二甲氨基丙腈及過硫酸銨濃度分別為0.25%及0.7%。電泳電壓以7—10伏/厘米較為合適。但電泳時(shí)間較長，約2—3小時(shí)，室溫低時(shí)可以電壓稍高。如果室溫較高則可以在冰箱中進(jìn)行電泳。

2．人血清及其酒精分劃部分的凝膠電泳

采用上述條件我們進(jìn)行了正常人血清的凝膠電泳。一般可以分成15—20條區(qū)帶。我們也根據(jù)RaFmand介紹的兩向電泳方法比較了紙電泳和凝膠電泳各區(qū)帶的相對關(guān)系。紙電泳上的a：區(qū)帶在凝膠電泳中可被分離成10條以上區(qū)帶。但紙電泳中d，區(qū)帶的一部分則與凝膠電泳中自蛋白區(qū)帶相重合。二種電泳方法所得的圖譜見圖版9。在正常人血清中后白蚤白（PA）、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tr）和觸珠蛋白（HP）均有不同的型， 一例骨髓瘤病人血清的和凝膠電泳自由電泳圖譜的比較見圖版11、12。我們也比較了酒精分劃人血漿各部分的紙電泳和凝膠電泳圖譜，結(jié)果見圖版13。從圖中可見在紙上電泳檢定時(shí)看來較純晦白蛋白和丙種球蛋白部分，在凝膠電泳中可見明顯的其他蛋白區(qū)帶。

3．放射病狗血清蛋白電泳的觀察 放射病動(dòng)物血清蛋白的改變可以在紙電泳中觀察到。一般認(rèn)為狗在照射后吻球蛋白有增高。用凝膠電泳觀察可以得到更深入的資 料。正常狗血清的凝膠電泳圖譜大致與人相 似。狗受致死量照射后第九天有明 顯變化，至極期時(shí)則可以觀察到鴨、Tr、融及 sp等區(qū)帶有明顯增高。我們用胎3—10型光 譜儀用光密度計(jì)將電泳圖譜進(jìn)行了掃描，所得 結(jié)果見圖3，圖版14。由于儀器的限制光縫 最小只能達(dá)到0．5毫米，從而影響了其分辨力。但與正常血清對比可以見到其改變的情況，這 遠(yuǎn)比紙電泳中所見更為明顯。我們認(rèn)為如果聯(lián) 系臨床表現(xiàn)對變化的本質(zhì)進(jìn)行一些研究，將有 助于了解放射病極期來到前后體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的一些情況。

4．在分離正常人尿DNase時(shí)的凝膠電泳 觀察 用葡聚糖凝膠分離人尿中DNase時(shí)可以除去大部分其他蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。但分離所得的制品用凝膠電泳觀察還可以見到五條以上的蛋白質(zhì)區(qū)帶（見圖版14）。將凝膠條在未染色前置于含大分子DNA的瓊脂平板上，在37c’溫箱中保溫2—3小時(shí)，再用5%三氯醋酸加至如此處理過的瓊脂板上，可以看到乳白色本底上出現(xiàn)被酶水解后的透明斑點(diǎn)。將凝膠條用氨黑染色后顯示其蛋白區(qū)帶的位置。二者比較就可以確定具有酶活性的成分的相應(yīng)電泳位置。我們的試驗(yàn)中觀察到人尿DNase在凝膠電泳中至少被分離成二條以上有酶活性的區(qū)帶。說明有同功酶的可能。應(yīng)用這一方法可以較深人地觀察體液中酶的情況。同時(shí)也說明可以用凝膠電泳來指示生物制劑制備過程中純化的情況。

四、結(jié) 論

本文介紹了聚丙烯酰胺凝膠電泳的一些初步實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并與紙電泳、自由電泳等進(jìn)行了對比。從結(jié)果中可以看到聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨力較強(qiáng)，重演性良好。它在臨床生化分析及生物活性物質(zhì)的分離、制備中和純度鑒定中具有較廣泛應(yīng)用的可能性。

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