超氧化物歧化酶(EC1. 15. 1. 1，簡(jiǎn)稱SOD)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類金屬酶，根據(jù)金屬輔基的不 同可分為Mn-S0D、Fe-S0D和CuZn-SOD 3種類型，近年來還從鏈霉菌屬中發(fā)現(xiàn)了 Ni-S0Dtu，從日本沼蝦 中純化66. 1 ku的EC-S0D，發(fā)現(xiàn)了倉鼠和人胞質(zhì)中的240 ~260 ku及135和270 ku的EC-SOD125，它們都 具有催化超氧陰離子自由基形成過氧化氫和水的反應(yīng)能力，在防御活性氧對(duì)生物體的傷害、在植物的逆境 生理、在預(yù)防和治療由自由基誘發(fā)的一系列疾病,如腫瘤、輻射損傷、心腦血管疾病等方面都起到了很電要 的作用.對(duì)3種類型SOD同工酶的分離和鑒定是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中會(huì)遇到的實(shí)際問題，通常都是采用聚丙 烯酰胺凝膠電泳（PAGE)的定位染色法f3],我們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)樣品點(diǎn)樣量少時(shí),SOD弱帶難以顯示， 點(diǎn)樣量大時(shí)植物次生物質(zhì)對(duì)酶帶顯示有干擾，且譜帶清晰度和重復(fù)性都不理想，時(shí)有譜帶重疊現(xiàn)象出現(xiàn)， 譜帶分離的/?/值與酶類型間無特定規(guī)律可尋，在改用聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳（GPGE)后得到了較滿意 的效果.本文將通過GPGE和PAGE的比較，旨在建立用GPGE分離和鑒定SOD同工酶的新方法.
1材料和方法
1.1材料、主要試劑及儀器
新鮮的植物材料采A南京地區(qū)和本院溫室，當(dāng)天采集后，用蒸餾水洗凈后備用.
枸杞Fe-SOD、牛血SOD及花生CuZn-SOD分別按其文獻(xiàn)14?純化至電泳純•丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰 胺、SDS、甲硫氨酸（Sigma) ,NBT(南京卓爾生化有限公司），其它試劑為閏產(chǎn)分析純或生化試劑.主要儀器 為島津CS -9000雙波長(zhǎng)薄層掃描儀，CSR -4高壓電泳儀，梯度凝膠電泳灌膠裝置.
1.2方法
1.2. 1 SOD粗酶液的制備
將實(shí)驗(yàn)材料剪碎，按每克鮮重加人3 mL的50 mm〇I/L磷酸緩沖液（PH7. 8)進(jìn)行研磨勻漿，勻漿液 10 000 r/min離心15 min后，上清液即為枏酶液，用于實(shí)驗(yàn)或分裝于小離心符內(nèi)，-25T保存?zhèn)溆?
1.2.2SOD同工酶的電泳分離和染色定位
PAGE按羅廣華等[3]方法，在7. 5%或10%的分離膠上進(jìn)行;GPGE按程光宇等m及張龍翔[8]方法，在 4% ~35%梯度膠上進(jìn)行，加樣前以100 V穩(wěn)壓預(yù)電泳30 min,加樣后在4T電泳，先以150 V穩(wěn)壓電泳1 h 后，將電壓逐步提高到300 V穩(wěn)壓電泳15 h(電泳持續(xù)4 500 V • h以上）；二次電泳按程光寧等w方法進(jìn) 行，第一向?yàn)?0%的PAGE，在電泳結(jié)束后切取具有SOD活性E未經(jīng)染色的K帶，放在已預(yù)電泳過的4% ~35%梯度膠上端，加人PAGE中3. 5%的濃縮膠液，采用光照聚合將其固定后進(jìn)行第二向GPGE,同時(shí)以 相同酶液量在梯度膠上點(diǎn)樣.電泳結(jié)束后進(jìn)行酶活性染色，采用拍照或掃描方法記錄SOD同工酶圖譜.
1.2.3SOD同工酶類型的鑒定
(1)參照Bridges和Salin的方法[1°]，以KCN和H202兩種抑制劑鑒定SOD類型.
(2)利用梯度膠具有分子篩效應(yīng)w及其/?/值與3種SOD相對(duì)分子質(zhì)量存在差異[111的特點(diǎn)，由/?/值 初步判斷SOD類型.
(3〉利用CuZn-SOD對(duì)SDS不敏感、Mn-SOD和Fe-SOD對(duì)SDS敏感的特性[ll’m9]，向粗酶液中加入 SDS溶液使其終濃度達(dá)1 %后，于371保溫1 h,分別進(jìn)行SOD同1：酶的GPGE和PAGE并進(jìn)行酶活性染 色.CuZn-SOD對(duì)SDS不敏感，譜帶留存,Mn-SOD和Fe-SOD對(duì)SDS敏感，譜帶消失.
2結(jié)果與分析
2.1GPGE和PAGE對(duì)分離SOD同工酶的影響
結(jié)果見圖1.14種植物的3種類型SOD在4% -35%的梯度膠中都得到較好的分離，譜帶清晰，未見 有干擾現(xiàn)象，根據(jù)/?/值可分為A、B、C 3個(gè)區(qū)域:A區(qū)的/?/值最小（<3. 6),譜帶都為1條;C區(qū)的/?/值最 大（>5.0)，其中譜帶數(shù)目因植物種類不同而異，如羊蹄、拔契僅有1 ~2條，而鴨趾草、馬兜鈴等則多于4 條;B區(qū)取值位于A、B區(qū)之間，如省譜帶一般都為1條，但許多植物缺乏這種類型譜帶.同時(shí)，從其/?/值 大小，還可初步判定各同工酶的相對(duì)分子質(zhì)量和類型，取值最小的A區(qū)同T酶相對(duì)分子質(zhì)量最大，應(yīng)為 Mn-S0D;ft/最大的C區(qū)同工酶相對(duì)分子質(zhì)量最小，應(yīng)是CuZn-SOD;而介于兩者之間B區(qū)的同T酶可認(rèn)為 是Fe-SOD，如南苜蓿、金蕎麥的Fe-SOD。
同一樣品在相同加樣量下進(jìn)行10% PAGE,SOD譜帶分離效果遠(yuǎn)不如GPGE,譜帶分布及/?/值與 SOD類型之間無特定規(guī)律可尋，其中紫花地丁中的次生物質(zhì)對(duì)SOD顯示干擾并影響到周圍的譜帶（圖1 的11).可見，在PAGE中SOD的/?/值因受電荷、膠濃度、pH值等多種因素影響，不能作為SOD類型鑒定 的依據(jù)，在GPGE中的切值棑除了電荷等因素的影響，與分子大小有相關(guān)性,故它可用于測(cè)定天然酶和蛋 白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量的靈敏度和分辨率比較
以牛血SOD為標(biāo)準(zhǔn)，比較GPGE和PAGE檢測(cè)SOD的靈敏度和分辨率（見圖2).當(dāng)以相同加樣量分 別進(jìn)行GPGE和PAGE時(shí)，在PAGE圖譜上S0D的檢測(cè)濃度為1. 56 x l〇_l3mol，在GPGE圖譜上，SOD濃 度為1. 56 x l〇-14m〇l時(shí)譜帶清晰，當(dāng)再稀釋10倍后仍能見到SOD譜帶（圖片未列出），說明PAGE和 GPGE檢測(cè)SOD的靈敏度分別為1. 56 x 10 —l3mol和1. 56 x 1(T15mol.在GPGE圖譜中牛血SOD活性染色 與蛋白染色帶邊緣清晰，呈扁平狀，在1. 56 x 10_12mol SOD時(shí)活性染色帶可分辨出1條主帶和2條次帶 及1條弱帶（圖2中A3)，與6. 24 x l(T9m〇l SOD時(shí)的蛋白帶相互對(duì)應(yīng)（圖2中B5);而在同樣加樣量下的 PAGE圖譜中譜帶邊緣模糊，只能分辨出1條主帶和1條次帶（圖2中C10).說明GPGE比PAGE有更高 的分辨率.
花生SOD粗酶液（125 U/mL)分別以1 pL進(jìn)行GPGE和PAGE時(shí)，在GPGE圖譜上Mn-SOD和CuZn- SOD譜帶非常清晰（圖2的13)，但在PAGE圖譜上已無明顯的譜帶（圖2的19) •花生CuZn-SOD在GPGE 中分別加樣〇. 016 jig和0. 128 (ig，在PAGE中分別加樣0. 032 jtg和0. 32 jig時(shí)，低、高濃度SOD譜帶掃描后峰面積之比分別為1:3. 37和1:1. 54.從圖1和圖4還能看出南苜蓿、番茄、金蕎麥等在梯度膠上顯示出 4 ~5條帶，但PAGE圖譜上顯示2 ~3條.純化的枸杞Fe-SOD有3條帶，但在GPGE上的靈敏度和分辨率 明顯高于PAGE(圖3的4,9).可見,對(duì)于植物的粗酶液和純酶，GPGE同樣比PAGE有較高的靈敏度和分 辨率.
2.3不同膠濃度對(duì)3種SOD類型分離和鑒定的影響
枸杞和香櫞都含有3種類型S0D，它們?cè)诓煌z濃度下的分離結(jié)果見圖3.枸杞在7. 5% PAGE中有3 條Fe-SOD，它們的/?/最大,CuZn-SOD也有3條，它們的/?/居中，Mn-SOD不成條帶，很難確定•在10% 的PAGE中3條Fe-SOD帶上移已與第三條CuZn-SOD相重疊，Mn-SOD帶已能基本分清.同時(shí)可見在
7.5%和10%的PAGE中還存在CuZn-SOD抑制不完全的現(xiàn)象，經(jīng)KCN和H202處理后在負(fù)極處的一些譜 帶性質(zhì)也很難判斷;在4% ~ 35%的梯度膠中3種類型SOD譜帶完全分離，F(xiàn)e-SOD帶上移至Mn-SOD和 CuZn-SOD間，與純化的Fe-SOD有相同的值.香櫞SOD在10%的PAGE中，有1條對(duì)KCN和H202都 敏感的CuZn-SOD譜帶，它的/?/值最小，Mn-SOD和Fe-SOD即使以抑制劑處理，也因未分離開和分辨率差 無法判斷.在4% ~35%的梯度膠中3種SOD同工酶都有規(guī)律地完全分開，/?/值最小的1條為Mn-SOD，甩 值較大的2條為CuZn-S0D，i?/值位于兩者之間的為Fe-SOD.
可見，枸杞和香櫞的3種SOD類型，它們?cè)?.5%和10%的PAGE中分離難有規(guī)律可循，如香櫞 CuZn-SOD的/?/值在同工酶中最小（圖3D)，同為Fe-SOD,在枸杞中的/?/值最大（圖3A)，在朱拮中/?/值 卻最小（圖5A).當(dāng)用KCN和H202鑒定SOD類型時(shí)，常有抑制不完全的現(xiàn)象，有的因譜帶重疊，即使采用 抑制劑也很難有結(jié)果，如香橡的Fe-SOD、Mn-S0D(圖3D)和朱桔的Mn-SOD、CuZn-S0D(圖5A).但在4% -35%梯度膠上，如存在Fe-SOD時(shí)，其取值總是位于Mn-SOD和CuZn-SOD之間，枸杞、香櫞和朱桔3種 類型SOD在梯度膠上均有此規(guī)律可尋.在梯度膠中以其取值大小判斷SOD的類型的結(jié)果與用抑制劑處 理的結(jié)果完全一致.
樣品經(jīng)1% SDS處理后，以相同量分別進(jìn)行GPGE和PAGE,結(jié)果見圖4.在梯度膠中，7種植物在A 區(qū)的SOD譜帶活性都被SDS抑制，無一例外，表明它們都是Mn-SOD;C區(qū)的SOD譜帶對(duì)SDS不敏感，為 CuZn-SOD,其中金蕎麥和還亮草都含有1條對(duì)SDS敏感的譜帶，但它們經(jīng)KCN和H202處理譜帶消失，具 有CuZn-SOD的典型特征，這些譜帶的/?/值在經(jīng)SDS處理前后一致• B區(qū)帶中被SDS抑制的為Fe-SOD, 其中代代花和南苜蓿的Fe-SOD的含量大于30%，金蕎麥、馬兜鈴、無花果、三葉草都含有對(duì)SDS敏感的 Fe-SOD(結(jié)果待發(fā)表）•經(jīng)SDS處理后留存的為CuZn-SOD，而Mn-SOD和Fe-SOD譜帶消失，Mn-SOD和 Fe-SOD的區(qū)分則可根據(jù)它們?cè)贕PGE圖譜上的/?/值確定.由此可見，GPGE結(jié)合SDS處理是SOD類型鑒 定的有效途徑之一.
結(jié)果見圖5.朱桔在二次電泳（圖5C)中的a、b帶 對(duì)應(yīng)于GPGE圖譜上的a、b帶（圖5B)和PAGE圖譜上 的a、b帶（圖5A)，分別為Mn-SOD和Fe-SOD,但在 PAGE圖譜上a帶/?/值大于b帶;c帶有2條為CuZn- S0D，在二次電泳和梯度膠中是相互對(duì)應(yīng)，但在PAGE 圖譜上a、c帶混雜，從純化的Mn-SOD和CuZn-SOD的 PAGE圖譜上可看出a、c是重疊帶^.在二次電泳中 新、老葉中Fe-SOD活性都約占SOD總活性的30%，與 GPGE中的結(jié)果相當(dāng)，但在PAGE中老葉這一比例約 30%，新葉低于5%.
從二次電泳中SOD譜帶在PAGE和GPGE中的對(duì) 應(yīng)關(guān)系可看出，朱桔3種SOD類型在GPGE中能按照 分子大小有效地分離和鑒別，但在PAGE中SOD譜帶 有重疊現(xiàn)象，分離不徹底，新葉中的植物次生物質(zhì)干擾 了 SOD活性顯示，甚至無譜帶.
3討論
目前國內(nèi)外在SOD同工酶的分離和鑒定研究中都是采用10%左右的PAGE，但分離效果和圖譜都不 很理想.我們?cè)阼坭焦麑?shí)SOD研究中采用了 GPGE,并首次報(bào)道了枸杞含有Fe-S0DK]，在隨后的研究中陸 續(xù)發(fā)現(xiàn)了何首烏、香櫞等十幾種高等植物存在Fe-S0D[14].迄今為止國內(nèi)外報(bào)道含F(xiàn)e-SOD的高等植物僅 番茄、銀杏、睡蓮、蕓苔、樟樹等十幾種U°’~9],SOD同工酶的分離也都是采用PAGE,我們的發(fā)現(xiàn)與用 GPGE替代PAGE研究SOD電泳技術(shù)改進(jìn)密切相關(guān)，但對(duì)GPGE分離和鑒定SOD類型和SOD譜帶在 GPGE與PAGE中相互對(duì)應(yīng)關(guān)系的研究H內(nèi)外尚未見報(bào)道，本文對(duì)此進(jìn)行了初步探討.
3.1 GPGE比PAGE能更有效地分離和鑒定SOD同工酶類型
本研究表明，在GPGE圖譜上的SOD譜帶可明顯分為A、B、C 3個(gè)區(qū)，A區(qū)/?/值最小，對(duì)SDS敏感，為 分子量最大的Mn-SOD;C區(qū)/?/值最大，對(duì)SDS不敏感，為相對(duì)分子質(zhì)量較小的CuZn-SOD;B區(qū)的譜帶甩 值位于二者之間，經(jīng)SDS處理后消失，為Fe-SOD•由于GPGE是根據(jù)孔徑大小分離酶和蛋白質(zhì)，其ft/值與SOD分子大小有相關(guān)性[8]，使酶的分離和鑒定變得相對(duì)容易和簡(jiǎn)單化，當(dāng)結(jié)合SDS處理時(shí)能將CuZn-SOD 和Mn-SOD、Fe-SOD區(qū)分開，由于Fe-SOD的/?/值通常位于Mn-SOD和CuZn-SOD間，故可確定SOD類型. 本文中枸杞、朱拮、香櫞存在的3種SOD類型符合這一規(guī)律，當(dāng)采用KCN和H202對(duì)枸杞、香櫞、金蕎麥和 還亮草等SOD類型進(jìn)行鑒定時(shí)，結(jié)果與GPGE中各譜帶取值與SDS處理相結(jié)合來確定酶類型的結(jié)果一 致，說明了將GPGE中各譜帶/?/值與SDS處理的結(jié)果相結(jié)合是分離和鑒定SOD類型的一種簡(jiǎn)便有效的 新方法.在傳統(tǒng)的PAGE中SOD譜帶受其所帶電荷、分子大小、膠濃度等多種因素影響,分離的取值變化 較大，如本文中Fe-SOD的/?/值在枸杞中最大，在朱桔中最小，/?/值與SOD類型及分子大小間無特定規(guī)律 可尋，鑒定SOD類型要采用KCN和H202等抑制劑，由于KCN為劇毒品，使SOD類型的研究受到了限制， 當(dāng)酶帶相互重疊時(shí)甚至無法有結(jié)果（如香櫞、朱桔等）.可見，在SOD分離和類型鑒定方面GPGE比PAGE 有更大的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景.
3.2GPGE分離SOD的靈敏度和分辨率
本文對(duì)GPGE和PAGE檢測(cè)SOD的靈敏度和分辨率進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，PAGE檢測(cè)牛血SOD靈 敏度為10_l3m〇l，GPGE檢測(cè)牛血SOD靈敏度可達(dá)10_15 mol.由于GPGE的靈敏度比PAGE高2個(gè)數(shù)量 級(jí)，可檢測(cè)到在PAGE圖譜上因含量很低難以顯示或活性低于5%的Fe-SOD譜帶（如馬兜鈴、無花果三 葉草等），它們的矽值都位于Mn-SOD和CuZn-SOD的B區(qū)之間.在GPGE圖譜中SOD譜帶清晰,點(diǎn)樣量 適中時(shí)為扁平形，邊緣明顯，有較高的分辨率，牛血SOD可清晰辨認(rèn)出4條帶，番茄和朱桔粗酶液可分辨 出4 ~5條帶，在PAGE圖譜中因干擾的存在大大影響了譜帶的分辨，它們的譜帶較模糊只有2 ~3條.純 化的枸杞Fe-SOD在GPGE和PAGE中都有3條帶，但前者的靈敏度和分辨率明顯高于后者.高的靈敏度 和分辨率使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，可見，GPGE分離SOD特別是Fe-SOD是比PAGE更好的方法.
3.3GPGE分離和鑒定SOD的可靠性
本文發(fā)現(xiàn)在C區(qū)對(duì)SDS敏感的譜帶（金養(yǎng)麥和還亮草）也能被KCN和H202抑制為CuZn-SOD,說明 了以/?/值來判斷SOD類型是可靠的.植物材料中的次生物質(zhì)豐富，它們會(huì)與SOD結(jié)合影響酶顯示[20]，朱 桔Fe-SOD(新葉）和何首烏Mn-SOD(圖片未列出）在PAGE中幾乎無帶，在GPGE中含量都達(dá)30%左右， 與二次電泳結(jié)果一致，提示在GPGE中經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間電泳后干擾物可能與SOD分離泳出凝膠，能真實(shí)反映出 全部SOD譜帶，而PAGE會(huì)造成一些SOD的漏檢.SOD譜帶在GPGE和PAGE中對(duì)應(yīng)關(guān)系由二次電泳反 映出來，GPGE中的SOD譜帶通過二次電泳都能和PAGE的相互對(duì)應(yīng),說明了 GPGE分離和鑒定SOD的 結(jié)果是可靠的，但PAGE中3種SOD類型的/?/值變化很大,與酶類型間無相關(guān)性，同時(shí)，通過二次電泳還 可以看出，GPGE對(duì)在PAGE上重疊和有干擾的SOD譜帶的分離和鑒定是有效的.