部分水解聚丙稀酰胺（partially hydrolyzed polyacrylamide，HPAM)以其良好的絮凝性被廣泛 用來提高原油的釆收率[1],聚丙烯酰胺注入地下 后，少部分隨原油被采出，而大部分存在于油層中，隨原油吸附在土壤及巖石表面，導致油井周 圍的土壤中含有大量的聚丙烯酰胺和原油，給環 境帶來危害[2]。微生物降解以其特有的無害化處理 將成為解決聚丙烯酰胺引起環境污染潛在毒性的 有效手段[3]。然而，游離微生物在處理含聚污水的 過程中菌體易流失，且污水中的一些有害物質會 對微生物產生毒害作用[4]。而微生物固定化技術可 以減輕或消除菌體的流失，并且使微生物保持活 性，可反復使用，固定化后微生物對有毒物質的 承受能力及對有機物的降解能力都有明顯的提 高[5]。因此微生物固定化技術成為生物及環境領域 的研宄熱點[6]。目前，微生物固定化的制備方法可 分為吸附法、共價法、包埋法和交聯法4種[7]。
作者采用微生物固定化方法處理聚丙烯酰胺污 染和石油污染的土壤，從污染土壤中篩選出聚丙 烯酰胺和原油高效降解菌，篩選出的菌株既可以 以聚丙烯酰胺作為唯一氮源又可作為唯一作為碳 源被利用，解決了之前研宄中聚丙烯酰胺只能作 為微生物繁殖的氮源不能作為碳源的缺陷。并且 選擇包埋固定化方法處理聚丙烯酰胺污染土壤。
1實驗材料
1.1土壤樣品
實驗用土壤采自大慶油田采油四廠的一口聚丙 烯酰胺與原油污染的井場，在離地表約5?20cm處 取樣，將取得的樣品裝入己經滅菌的樣品袋中， 密封。過40目篩，樣品放置于冰箱中4°C保存。
1.2培養基
(1)無機鹽培養基(g/L): K2HPCV3H20 1.0, NH4NO3 1.0 , KH2PO4 1.0，CaCl2 0.02， MgS04,7H20 0.5，FeCl3 痕量。
(2)分離、純化培養基(g/L):向上述（1)的 培養基中加入HPAM 0.5,瓊脂1.5%?2.0%，調節 pH值至7.2。
(3)活化培養基(g/L): HPAM0.5, NaC10.5， 蛋白胨 6.0,尿素 9.0，KH2P〇4〇.5, MgSO40.5。
(4)基礎培養基(g/L):向上述（1)的培養基 中加入HPAM0.5,調節pH=7.0。
(5)菌種保藏斜面培養基：牛肉膏蛋白胨培養 基（細菌）和馬丁氏培養基（真菌）。
2實驗方法
2.1菌種篩選與鑒定
(1)菌種篩選將10 g聚丙烯酰胺污染的土 壤樣品加入到含聚丙烯酰胺100 mg/L，葡萄糖500 mg/L的上述1.2節（1)的無機鹽培養基中，HZQ- X100立式恒溫振蕩培養箱，120r/min，35 °C下培 養，待培養液變渾濁，吸取5 mL培養液，將移取 的液體加到含聚丙烯酰胺300 mg/L,葡萄糖 300 mg/L的培養基中放入恒溫振蕩培養箱繼續培 養，重復上述過程直到細菌在含聚丙烯酰胺 500 mg/L,葡萄糖濃度為0 mg/L的培養基中能生 長為止。制作上述1.2節（2)的分離、純化培養 基，接種環挑取微生物培養液在培養基上劃線， 劃線之后將培養基放入溫度為35 °C，轉速為120 r/min的振蕩培養箱中培養，待長出菌落后，通過 電鏡觀察菌株是否純化。
(2)菌種鑒定微生物菌株的形態觀察與生理 生化反應參照常見細菌系統鑒定手冊[8]與伯杰氏細 菌鑒定手冊。將菌株初步鑒定到屬。
2.2測定方法
(1)聚丙烯酰胺降解率的測定：采用淀粉-碘 化鎘比色法測定聚丙烯酰胺的濃度。
(2)土壤原油含量的測定：分光光度法[9]。
23菌體生物量的測定
采用722型可見分光光度計測定溶液的0£>66〇 值（光密度）來表示生物生長量的多少，〇£>值是 物質在溶液中吸收特定波長光線強弱的參數。在 波長為660 nm處對含聚丙烯酰胺的微生物培養液 進行光密度的測量，光密度值與菌群菌數成正 比。將單菌以3%的體積比接入1.2節（4)的基礎 培養基中，在35 °C、120 r/min條件下放入振蕩培 養箱中培養，以蒸餾水作為空白對照進行測定， 以此作為微生物菌群生長曲線的參考指標。
2.4單一菌種與混合菌降解聚丙烯釀胺和原油的 效果比較
將活化后的單一菌種與4種單菌Rl，R2, R3, Y3的混合菌按照3%的總體積分數分別加入上 述1.2節（4)的基礎培養基中，于35 °C、120 r/min 條件下放入振蕩培養箱中培養。3天后測HPAM與 原油的去除率，比較單一菌種與混合菌種對 HPAM和原油的降解效果。
2.5微生物固定化顆粒的制備
(1)制備濕菌體將篩選出四種單菌的混合菌 作為固定化的菌體，將菌株依次接入200 mL的1.2 節（3)所示的活化培養基中，經過4次連續活化。 取活化后的培養液2 mL加入到200 mL的富集培養 基中培養2?3天，富集培養基經離心機離心，得
到濕菌體。
(2)包埋法固定化顆粒的制備4種固定化方 法中包埋固定化法以其操作簡單，對微生物活性 影響小，制作的固定化微生物小球的強度高等優 點優于其它3種固定化方法，所以本實驗采用包埋 法。以蒸餾水配置一定濃度的包埋載體溶液，加 入一定量的濕菌體，用5 mL注射器吸取載體溶 液，將載體溶液滴入一定濃度的交聯劑中，交聯 一定時間，將固定化顆粒放入200 mL的1.2節(4) 所不的基礎培養基中，35 °C，120r/min振蕩培養 箱中培養降解聚丙烯酰胺。
(3)5種包埋固定化制備方法采用5種包埋 法進行微生物的固定化，5種包埋固定化法制備微 生物固定化顆粒的條件如表1所示。
按照表1中的制備條件制備固定化顆粒，比較 5種包埋法制備微生物固定化顆粒的難易程度、小 球強度和初性以及制備費用，從中選擇一種制備 費用低廉、制備容易、強度和初性都較好的包埋 方法。
2.6微生物固定化顆粒降解HPAM和原油的效果
以固定化顆粒對聚丙烯酰胺的降解率與對原油 的去除率來比較幾種包埋固定化方法。按照表1中 的5種包埋固定化制備方法，制作固定化顆粒，各 稱取10 mL載體與濕菌體的混合物制得的固定化顆 粒，分別放入200 mL的1.2節（4)所示的基礎培 養基中，在35 °C, 120 r/min振蕩培養箱中培養3 天，測聚丙烯酰胺的降解率。
2.7微生物固定化處理采油污水污染土壤
取大慶油田采油四廠的一口井場取回的聚丙烯 酰胺與原油污染土壤，先除去其中的磚塊、瓦礫 等雜物后自然風干，再將土樣過40目篩，得到顆 粒大小均勻的土樣，將土壤樣品加入到1.2節（1) 所示的200 mL基礎培養基中，測得培養基中聚丙 烯酰胺濃度為500 mg/L,原油濃度為733.21 mg/L。取10 mL PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的 載體與濕菌體的混合物制得的固定化顆粒放入上 述培養基中，在35 °C，120 r/min振蕩培養箱中培 養，每3天測聚丙烯酰胺的降解率，并采用分光光 度法測原油含量。
3結果與討論
3.1菌種篩選結果
經分離純化得到4株對聚丙烯酰胺有降解效果 的菌種，即Rl、R2、R3、Y3。菌落圖片和菌株電 鏡掃描圖片如圖1所示。參照《伯杰氏細菌鑒定手 冊》及《常見細菌系統鑒定手冊》，可以初步鑒定： R1為芽孢乳桿菌屬，R2為微球菌屬，R3、Y3為 假單胞菌屬菌株。
3.2標準曲線繪制
以HPAM標準溶液濃度為橫坐標，可見分光 光度計測得的〇/)42〇值為縱坐標繪制的HPAM濃 度-吸光度標準曲線。曲線的線性回歸方程為 y=0.0386jc+0.0019，/?2=0.9995。測定待測溶液吸光 度值，即可從線性回歸方程計算出待測溶液的實 際HPAM濃度。
33單菌生物量的測定
以〇乃66()值代表細菌的生物量，菌體生長量越 多，培養基越渾濁，〇/?66()值越大。因此，OD66f) 值越大。表示菌體生物量越多。微生物生長曲線 如圖2所示。
如圖2所示，微生物的生長曲線反映一種微生 物在一定生活環境中的生長繁殖和死亡規律。由 圖2的生長曲線可以看出，4種菌體在含500 mg/L 聚丙烯酰胺的培養基中生長繁殖，菌體經歷了停
表1 5種包埋法制備微生物固定化顆粒的條件
包埋方法包埋劑/g蒸餾水
/mL濕菌購載 體質量比交聯劑交聯時間
海藻酸鈉+活性炭粉海藻酸鈉2,活性炭0.5481:24% 的 CaCl224 h
海藻酸鈉包埋與戊二醛交聯結合海藻酸鈉2,活性炭0.5481:24%的CaCl21.0%的戊二醛戊二醛交聯1?2天
PVA+海藻酸鉆+添加劑PVA10,海藻酸鈉1901:22%的CaCl2飽和硼酸溶液CaCl2與飽和硼酸共同交聯24 h
Si〇2 3, CaC〇3〇.3
PVA冷凍PVA4,海藻酸鈉1451:24% 的 CaCl2于冰箱冷凍室在-i5 °c下冷凍過夜，
再在室溫下解凍，重復冷凍解凍4次
明膠一戊二醛明膠201001:21.0%的戊二醛戊二醛交聯2天
高于4種單菌，混合菌對HPAM的降解率在第3 天基本保持穩定，達到55%以上，對原油的去除率 可達到75%以上。這可能是由于單一菌種不具備一 整套完整的酶系統或基因成分降解這些不易降解 的有機物，而微生物群落中不同基因的擁有者卻 可能發生基因交換或重組，從而導致新的降解途 徑的實現。
3.5微生物固定化
(1)5種包埋方法比較對5種包埋法的制備 難易程度、固定化后小球的強度和軔性及制作成 本進行對比，結果如表2所示，海藻酸鈉包埋與戊 二醛交聯結合法與明膠-戊二醛法這兩種方法制作 費用高，且明膠-戊二醛法操作較困難，制成的固 定化顆粒形狀不規則，海藻酸鈉包埋與戊二醛交 聯結合法制備的小球初性、強度一般。因此排除 海藻酸鈉包埋與戊二醛交聯結合法與明膠一戊二 醛法這兩種方法，選用其余3種制備費用低廉的方 法測定固定化微生物顆粒降解HPAM和原油的 效果。
圖4混合菌與單菌對原油去除率的比較
滯期、對數期、穩定期和衰亡期。
3.4混合菌的優勢
由圖3、圖4可知，Rl、R2、R3、Y3四種單 菌組成的混合菌對HPAM和原油的去除率都明顯
5種包埋法制備固定化顆粒的難易程度、小球
• 950 •化 工進展2013年第32卷
表2 5種包埋固定化方法的比較
包埋方法制備難易小球強度和初性費用
海藻酸鈉+活性炭粉操作較簡單，成球容易，小球體積較小小球有一定的韌性，但強度不好，易破碎較低
海藻酸鈉包埋與戊二醛交聯結合操作較簡單，成球容易，小球體積較小小球韌性、強度較一般較高
PVA+海藻酸鈉+添加劑操作較簡單，成球容易，小球體積較大固定化小球韌性一般，但強度好，球體硬低
PVA冷凍操作相對簡便，較易成球，小球體積較小強度一般，韌性很好低
明膠一戊二醛操作較困難，明膠黏性較大，不易成球，小球的形固定化小球強度很好，有初性較高
狀不規則
表3固定化顆粒降解HPAM和原油的效果
包埋方法聚丙烯酰胺的降解率/%原油去除率
海藻酸鈉+活性炭粉60.381.4
PVA+海藻酸鈉+添加劑78.298.3
PVA冷凍61.481.2
強度和初性以及制備費用比較如表2所示。
(2)微生物固定化顆粒降解HPAM和原油的 效果通過由表2篩選出的3種包埋固定化方法制 得的固定化顆粒對聚丙烯酰胺的降解率的測定， 結果如表3所示，海藻酸鈉+活性炭粉法與PVA冷 凍法對聚丙烯酰胺降解率與對原油的去除率低于 PVA+海藻酸鈉+添加劑法。因此，排除海藻酸鈉+ 活性炭粉法與PVA冷凍法兩種方法。
綜合表2與表3,得知PVA+海藻酸鈉+添加 劑法制得的固定化顆粒的活性較好，操作簡 單，強度好，不易破損，且費用低，PVA+海藻 酸鈉+添加劑法對聚丙烯酰胺的降解率高于其它 兩種包埋方法。因此選用PVA+海藻酸鈉+添加 劑法對含聚丙烯酰胺的土壤進行處理。張秀霞 等[1()]以天然有機材料YJ-05為載體，采用吸附 法制備固定化MM-7對土壤中石油的降解率可 達到27.1%。
由之前的實驗3.4節混合菌的優勢可知，游離 的混合菌對HPAM降解率達到55%以上，對原油 的去除率可達到75%以上，而由表3得知在相同實 驗條件下PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的固定化 顆粒對聚丙烯酰胺的降解率可達到78.2%，對原油 的去處率可達到98.3%。可見固定化后的菌株對聚 丙烯酰胺與原油的處理能力要遠遠強于沒有固定 化的游離菌株。
PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的固定化顆粒 如圖5所示。圖5(a)為10%PVA-1%海藻酸鈉與濕 菌體按1 : 2體積比混合后，加入3%Si02,
0.3%CaCO3。用5 mL注射器注射到2%的CaCl2飽 和硼酸溶液中成球，CaCl2與飽和硼酸共同交聯24 h后的固定化顆粒，顆粒并無拖尾現象。圖5(b)為 在相同制備方法時加入3%的活性炭制得的固定化 顆粒，以增加固定化顆粒的通透性，提高微生物 的活性。
3.6微生物固定化處理采油污水污染土壤
PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的微生物固定 化顆粒處理采油污水污染的土壤，處理后的土壤 樣品放入電熱鼓風干燥箱中干燥后送回井場，固 定化顆粒降解土壤中HPAM和原油的效果實驗結 果如表4所示。由表4可以看出，PVA+海藻酸鈉+ 添加劑法制備的固定化顆粒對采油污水污染土壤 進行處理，固定化顆粒對HPAM、原油的去除率 分別為79.5%和98.7%。
表4固定化顆粒降解土壤中HPAM和原油的效果
時間
/dHPAM含量 /mg-L_IHPAM降解率
/%原油含量 /mg.L_1原油降解率
/%
0500.050733.210
3102.5179.519.598.7
622.2178.31.5184.1
97.6265.70.3676.2
123.2157.80.0975
151.4156.10.0455.6
180.62560.0250
210.27560.0150
4結論
(1)實驗以篩選出以聚丙烯酰胺作為唯一碳 源和唯一氮源的菌株為目的，從含HPAM的土壤 中分離、純化得到對HPAM具有高效降解能力的 Rl、R2、R3、Y3四種單菌。對篩選出的單菌進行 鑒定可知：R1為芽孢乳桿菌屬，R2為微球菌屬， R3、Y3為假單胞菌屬菌株。
(2)將 Rl、R2、R3、Y3 混合，在 35°C, 120 r/min條件下，混合菌對HPAM的降解率可達到 55%以上，對原油的去除率達到75%以上。明顯高 于4種單一菌種對HPAM和原油的去除率。
(3)為提高混合菌對聚丙烯酰胺與原油的去除 率，采用固定化法對混合菌進行固定化實驗。比 較5種包埋固定化法得知，PVA+海藻酸鈉+添加劑 法對聚丙烯酰胺與原油的去除率高于其它4種包埋 固定化方法。PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的固 定化顆粒的活性較好，操作簡單，強度好，不易 破損，且費用低。
(4)游離的混合菌對HPAM與原油的去除率 可達到75%與55%以上，而PVA+海藻酸鈉+添加 劑法制得的固定化顆粒對聚丙烯酰胺與原油的去 處率可達到78.2%與98.3%。可見固定化后的菌株 對聚丙烯酰胺與原油的處理能力要遠遠強于沒有 固定化的游離菌株。
(5)PVA+海藻酸鈉+添加劑法制備的固定化 顆粒對采油污水污染土壤進行處理，聚丙烯酰胺 的去除率可達到79.5%，原油的去除率可達到 98.7%。