凝膠毛細管電泳信號由自行設計的激光誘導熒光檢測系統(tǒng)檢測[7]，不同的電場強度下，光電倍增 管數(shù)據(jù)采集頻率為50 Hz，采用電動進樣，由計算機程序精確控制進樣時間和進樣電壓，從而消除進樣 量的偏差(300 V/cm，進樣5 s)，毛細管溫度由TEC裝置進行溫控,從進樣端直至檢測端保持在40尤。 3結(jié)果與討論
3.1遷移率的測置
通過毛細管凝膠電泳分離DNA樣品，電泳場強依次為：100、125、150、175、200、225、250、275、300、 325、350和375 V/cin。80 ~587 bp范圍內(nèi)的11個片段，每種電場強度下重復分離3次,計算得到平均 遷移率和標準偏差。測得不同長度片段的遷移速度與電場強度的關(guān)系如圖1所示，相對平均標準偏差 為3%。粒子在電場中運動，除了受到電場力的作用，還會受到溶劑阻力的作用，一定時間后，兩種力作 用就達到平衡。電泳遷移率為：
fL - v/E = q/6irr)r(1)
式中，f和r分別是球形離子的運動速度和有效半徑，17是溶劑粘度。
圖1中采用4% LPA為篩分介質(zhì)，可清楚看出電泳速度與電場強度成正比，電泳速度還和DNA片 段長度有關(guān)，片段長度越小，電泳速度越快。從公式（1)來看，遷移率與電場強度無關(guān)。但在實際溶液 中,離子不可能只有一種，電泳的有效淌度還與離子半徑、溶劑化作用、介電常數(shù)、溶劑粘度、離子形狀、 電荷、PH、離解度等諸因素有關(guān)。在實驗中，電場強度很大程度上影響著電泳遷移率。圖2是由實驗數(shù) 據(jù)得到的不同電場強度下測量遷移率的對數(shù)與DNA片段長度(80 ~587 bP)關(guān)系曲線圖。
針對小分子和低場強;Reptation(爬行）無拉伸 區(qū)，針對稍大的分子和較高的場強的情況;Reptation拉伸區(qū)，針對更大的分子和更髙電場強度。
3.2.1 Ogstcm區(qū)Ogston模型中描述帶電大分子通過高聚物網(wǎng)絡的遷移行為:認為凝膠可看成是固 定網(wǎng)孔的分布，平均孔徑大小依賴于凝膠成分，尤其是聚合物濃度和交聯(lián)程度。對遷移的球形粒子來 說，理論假設遷移率和篩孔部分的體積成比例，凝膠形成的基質(zhì)網(wǎng)孔沒有大到影響遷移物質(zhì)的形狀，它 的主要作用是作為一種分子篩。在這種條件下，孔隙尺寸認為比DNA分子尺寸大得多。分離過程是在 遷移溶質(zhì)能夠找到一個足夠大的孔隙可以利用的基礎上完成的。根據(jù)這種假設，得到Ogston等式，溶 質(zhì)在凝膠基質(zhì)中的電泳遷移率的表達式為：
fi =/t〇exp(-aC(r + J?g)2)(2)
式中抑是溶質(zhì)在自由溶液(無限稀釋溶液）中的電泳淌度,a是比例常數(shù)，C是凝膠狀聚合物的濃度， r為聚合物股繩厚度，'是遷移粒子(溶質(zhì)）的半徑，假定遷移的DNA分子是理想的彈性球形粒子，則 »iV1/2，/V是DNA分子核苷單元的鏈長，且假定遠大于r，得到：
fi = /i〇exp( - KCN)(3)
這里，X為常量。兩邊取對數(shù)：
lryt = Vo - KCN(4)
從公式(4)可知，遷移率的對數(shù)與片段長度W呈線性關(guān)系。然而，由圖2可見，對于LPA篩分介質(zhì)，分離 雙鏈DNA樣品，電場強度100 ~375 V/cm變化，曲線沒有統(tǒng)一的斜率,并不滿足公式(4)。與文獻[10, 11]中交聯(lián)聚丙烯酰胺分離單鏈DNA大分子的情況不同，文獻中改變電場強度對DNA短片段（<200 bp)的遷移率基本無影響。而在本實驗中，使用LPA篩分介質(zhì)，在電場強度變化的情況下，短片段遷移 率的對數(shù)值雖然很靠近，但并沒有重合。說明在本實驗條件下,增大電場強度，不但對長片段的遷移率 影響很大，對短片段的遷移率也有較大影響，遷移率會隨著場強的增大而明顯增大，Ogstons模型失效。
A是依賴于在單個篩孔中的相關(guān)DNA長度的比例常數(shù)，并假設抑和A都不依賴于電場強度和片 段長度。這個理論主要闡明遷移率和片段長度的倒 數(shù)有一個線性關(guān)系，用實驗結(jié)果作遷移率和1/W的 雙對數(shù)曲線，如圖3所示。如果是符合Reptation無 拉伸理論，那么這個區(qū)域應該有一個相等的斜率，這 在雙鏈DNA瓊脂糖凝膠w中觀察到了此現(xiàn)象。而 圖3中曲線只是在一段區(qū)域內(nèi)（>300 bP)呈線性，
更重要的是圖3缺乏統(tǒng)一的斜率，因此，Reptation無 拉伸區(qū)的理論也不能很好地描述實驗結(jié)果。
a(
N
+ bE2
(6)
3.2.3Reptation拉伸區(qū)當DNA分子相對于凝膠 平均篩孔尺寸更大時,通常用Repation拉伸理論來 描述分離過程。這種條件下，分子量太大而不能輕 易通過篩分介質(zhì)孔隙，分子迂回前進，頭部首先通過 篩孔，隨著電場強度的增高分子的拉伸程度增大，遷移率對于分子量大小的依賴程度降低，而是更多地 依賴于電場強度["]。式(6)描述遷移率與DNA分子和電場強度的關(guān)系：
式中a是遷移率和分子量有關(guān)的常量，6是依賴于聚合物網(wǎng)孔大小、電荷以及粒子片段長度的常量。由 圖3看出，當£一定時與log(l/A〇并不是線性關(guān)系；圖4是實驗中任一 DNA片段的遷移率與電 場強度的平方的雙對數(shù)關(guān)系曲線，從圖4可看出：當/V—定時，遷移率與£2的雙對數(shù)并不是線性關(guān)系， 因此，實驗結(jié)果也不滿足Reptation拉伸理論。
3.3理論的修正
由以上理論分析，必須對原有理論作修正。首先,實驗結(jié)果如圖2中遷移率的斜率隨著電場強度的 改變而改變,說明篩分粒子大小和遷移率的關(guān)系會隨著電場強度而變。假定這種場依賴的〇gst〇n等式 并沒有失效，只是由于改變了 DNA的有效大小，假設DNA在遷移方向拉伸，變得細長更容易通過篩孔。 DNA分子的拉伸程度與所加電場強度與真實的DNA分子量大小有關(guān)，這種處理方法使實驗可以沿用 Ogston理論，而不受小分子和低電場條件的限制。
綜上所述，采用可替換的LPA作為篩分介質(zhì)進行雙鏈DNA毛細管電泳，利用激光誘導熒光檢測系 統(tǒng)檢測，實驗研究得出在不同電場條件下DNA分子的遷移率。用經(jīng)典的理論模型對實驗結(jié)果進行分 析，發(fā)現(xiàn)已有的經(jīng)典理論不能適用，采用修正的〇gston篩分模型解釋了 DNA毛細管WA凝膠電泳遷移 率依賴于電場強度與片段長度的關(guān)系，認為實驗數(shù)據(jù)偏離〇gston模型是由于DNA分子在高電場下發(fā) 生了形變，得到反映這種形變的簡單理論公式，使原來僅適用于低電場、小分子量以及球形粒子的 Ogston理論得到擴展，該公式提供了線性聚丙烯酰胺篩分機理的相關(guān)物理模型，改變篩分介質(zhì)濃度，實 驗現(xiàn)象也能用該模型很好地描述。此簡單模型能很好地估測DNA分子的不同片段長度在不同電場強 度下的遷移率，用它可以作簡單統(tǒng)一的曲線圖以了解在LPA凝膠系統(tǒng)下的電泳特性。