蛋白質(zhì)、核酸、葡萄糖、氨基酸等許多生物大分子的分離分析是毛細管電泳(CE)應用的重要組成部 分[1]。在蛋白質(zhì)的毛細管電泳分離中，由于疏水作用 、靜電作用及其它因素[3~6]的存在，使得樣品在 毛細管內(nèi)壁上產(chǎn)生吸附，導致嚴重的峰形拖尾、柱效低、重現(xiàn)性變差等問題，甚至樣品滯留在管內(nèi)不出 峰。解決此問題通常有以下幾種方法[3’7]:極端pH值法(緩沖液的pH 8 ~ 11或pH <2);緩沖液中加人 小分子添加劑（如:季銨鹽、陽離子表面活性劑、二胺類等）；毛細管內(nèi)壁的改性，通過物理涂布或化學鍵 合的方法制備改性柱。前兩種方法只能一定程度地減少吸附；pH過高或過低會引起蛋白質(zhì)變性；添 加劑濃度過大也可導致蛋白質(zhì)變性；電解質(zhì)濃度過高還會導致電流增大，對分離效果都會產(chǎn)生負面影 響。因此化學鍵合改性成為毛細管柱等分離通道處理最常用的方法[8]。此外，電滲流（EOF)的大小及 方向?qū)Ψ蛛x效果影響較大，需要選擇合適的電滲流[9]。
本研究采用化學鍵合法制備改性柱以減輕蛋白質(zhì)的吸附，通過改變酸、堿性單體的組成調(diào)節(jié)聚合物 的帶電狀態(tài)，從而有效調(diào)節(jié)電滲流，使之滿足分離的需要。
2實驗部分
2.1儀器與試劑
DZF 6020恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）； P/ACE MDQ高效毛細管電泳儀(美國Beckman公司），配紫外檢測器、P/ACE數(shù)據(jù)采集工作站。1 mL 微量注射器。
烯丙基胺、乙烯基橫酸鈉、丙烯酰胺(單體亞甲基雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑）、3-甲基丙烯酰氧丙 基三甲氧基硅烷（y-MAPS，98%，山東鵬浩化工）。其它試劑均為分析純。一次去離子水。毛細管 (75 jun i.d.，河北省永年銳灃色譜器件有限公司）；新鮮雞蛋。
2.2不同電荷聚丙烯酰胺改性柱的制備
毛細管預處理方法與文獻[10]基本相同。取一定長度的毛細管，分別用0.1 mol/L NaOH溶液和 水依次沖洗40 min，注人y-MAPS浸泡40 min，N2吹干，120丈恒溫干燥3 h。
取適量單體溶液溶于水，超聲至完全溶解。引入毛細管中反應40 min,N2吹干，120 ^恒溫過夜。
2.3樣品溶液的制備
取鮮雞蛋蛋清，溶于8倍體積碟酸鹽-尿素緩沖液(pH 5.60)中。隣酸鹽、尿素濃度均為10 mmol/L, 輕搖至蛋清溶解，過濾,4弋保存?zhèn)溆谩?/div>
2.4實驗方法
緩沖液使用前超聲脫氣10 min。分離柱每次實驗前用水和緩沖液依次沖洗5 ~ 10 min。正極端壓 力進樣后，施加一定電壓并啟動數(shù)據(jù)采集。電滲流標記物為硫脲（100 mmol/L)，溶于相應緩沖液中。
3結(jié)果與討論
3.1不同聚合物改性柱的電滲流
Table 1 Components of monomer solutions
單體 Monomer聚合物質(zhì)量P〇丨ymer(g)
12345
丙稀醜胺Aery丨amide0.23320.24060.20430.21050.2011
JV , /V-亞平基雙丙稀酰胺 JV，iV-Methylene-bis-acrylamide0.08440.08290.05050.08920.0864
過硫酸按 Ammonium persulfate0.54420.42880.29880.56210.5110
乙鋪基磺酸納Sodium vinylsu丨fonate0.1691
稀丙基胺Allylamine0.14421.00323.4251
將所用試劑加入20 mL水，配制5份單體溶液(表1)，制備相應的改性毛細管柱,并與空柱進行對比。 表1單體溶液配比
根據(jù)單體溶液的組成，聚合物將含有不同酸性和堿性基團。由表i可見,聚合物i中含有磺酸基， 聚合后也帶有相同基團，在緩沖溶液中發(fā)生電離，使改性柱內(nèi)壁帶永久負電荷;聚合物2不帶電，電滲流 源于未覆蓋硅羥基的電離;聚合物3 ~5含有氨基，在pH < 10的緩沖溶液中，其對應的改性柱內(nèi)壁由于氨 基的電離，會(部分)抵消硅羥基形成的負電荷。
圖1是電滲流的變化曲線，柱1未進行改性，
>
0.1
0.0
6
柱2~6分別由表1中聚合物1 ~5改性。與柱1 相比，聚合物改性之后電滲流顯著降低。含磺酸 基的聚合物涂層柱2中電滲流降約為原來的 36% ;中性聚合物2改性后，電滲流進一步降低， 低于原來的1/4。隨著單體溶液中烯丙基胺的濃 度增大（聚合物3 ~5),相應聚合物中氨基密度提 高，導致電滲流較小。烯丙基胺濃度為50 g/L (約1 mol/L,聚合物4)時，電滲流降到7%左右。 進一步增大烯丙基胺的濃度，電滲流變化趨緩。 如果將烯丙基胺的濃度進一步增加到150 g/L (3 mol/L,聚合物5)時，電滲流相對變化<20% (圖1，柱6)。
根據(jù)上述改性方法，通過調(diào)整乙烯基磺酸鈉、 烯丙基胺的濃度及比例，即可方便地制備電滲流
0.9
，0.8丨 0_7
' 0.6 £ 0.5 0.4
S〇-3 〇 0.2 2
不同的改性柱，用以適應不同的分離目的，從而可能實現(xiàn)高效、快速的蛋白質(zhì)分離。
3.2聚合物電荷不同對分離結(jié)果的影響
選取3根改性柱（圖1柱2, 3和5),其中的聚合物在所用緩沖溶液中帶電狀態(tài)不同，柱2聚合物含 磺酸基，帶負電;柱3聚合物不帶電;柱5聚合物含氨基，帶正電。在一定緩沖溶液中，各種聚合物的電 離狀態(tài)不同，預計將對電泳實驗產(chǎn)生不同影響。
3根柱子分別用于雞卵清蛋白質(zhì)的分離。之所以選擇雞卵清蛋白作為樣品，是因為其不但方便易 得，而且主要蛋白質(zhì)成分均有研究報道。結(jié)果如圖2,與非改性柱（結(jié)果未示出）相比，3根柱對蛋
白質(zhì)吸附均有改善，保證了分離的順利進行。柱2 電泳圖（圖2a)顯示，聚合物涂層對蛋白質(zhì)有一定 的吸附，尤其是其中的堿性組分如溶菌酶等，這應該 歸結(jié)于磺酸基的電離。柱3和5分別由中性、堿性 聚合物改性,電泳圖（圖2b和2c)峰形對稱，表明蛋 白質(zhì)的吸附被進一步抑制。電泳圖2c與2b相比，
遷移時間更短，峰形更加對稱,說明堿性聚合物改性 柱抑制蛋白質(zhì)吸附的效果最佳。
3.3緩沖液pH值對分離結(jié)果的影響
根據(jù)前述對改性柱分離度的比較,選擇堿性聚合 物改性的柱子(柱5)考察緩沖溶液對電泳的影響。
圖3是使用不同pH值緩沖溶液得到的電泳 圖。與圖2c比較可見，在所選實驗條件下，中性或 酸性條件下分離度變差，這是由于此時樣品組分，尤 其是堿性蛋白質(zhì)荷正電，產(chǎn)生了靜電吸附。pH 5.33 比pH 7.08出峰數(shù)目更少。由此可見，適當增加緩 沖液的pH值可改善分離效果。本研究選用 pH 9.0-10.5 之間。
3.4緩沖液濃度對分離結(jié)果的影響
選擇柱5考察緩沖液濃度對分離的影響，結(jié)果如圖4 所示。隨著緩沖液濃度的增大，分離度明顯改善，樣品出峰 數(shù)增多。當濃度為300 mm〇l/L時，淌度相近的卵清蛋白和 卵球蛋白也得到了分離（圖4c)。這是因為高濃度緩沖液 可以更有效地抑制了蛋內(nèi)質(zhì)的吸附。從圖4還可見，緩沖 液濃度越大，分離時間越長。說明高濃度緩沖溶液同時減 小了電滲流[14’15]，從而延長了組分遷移時間。而緩沖液濃 度過高會產(chǎn)生過大的焦耳熱效應，最終會降低分離度及柱 的壽命。本實驗中BBS溶液濃度選擇200 mmol/L。
本實驗采用原位合成聚合物改性毛細管柱的方法。通 過改變聚合物單體的組成來改變毛細管內(nèi)壁的帶電情況和 調(diào)節(jié)電滲流。結(jié)果表明，含有氨基基團的聚丙烯酰胺改性
的毛細管柱，能夠抑制蛋白質(zhì)的吸附，電滲流降低了至少90%，可以用于蛋白質(zhì)的電泳分離。