近年來，以重組DNA和單克隆抗體技術生產的蛋白質、多肽、酶、激素、疫苗、抗體和 細胞生長因子等生物技術藥物，成為了熒光漂白恢復技術越來越熱門的研究對象總體上它們具有幾個 共同的特點[2]:第一，分子量較大，熱穩定性差，易被蛋白質水解酶水解;第二，生物利用 度不高，具有較強的親水性，不易通過生物屏障;第三，具有特定的維結構，任何改變其 結構的化學物質和環境都會對生物活性造成很大的影響。生物大分子藥物透皮給藥技術 的發展，使蛋白類藥物能夠避免胃腸道的酶解和肝臟的首過效應，提高藥物的生物利用 度。與此同時，兼顧蛋白質類藥物穩定性的藥物載體的研究，也已經成為人們所關注的焦點。

現今比較常用的一種藥物載體是水凝膠，它廣泛應用于生物制藥等領域M.具有互 相貫穿的網絡結構的水凝膠能夠吸取大量的水形成穩定三維結構，蛋白質分子在水凝膠 中親水基團的幫助下，有助于保持其生物結構和活性?卡波姆(carb〇mer)就是其中一種 已經商品化的水凝膠[4]，根據材料和聚合度的不同可以分為兩個系列：卡波姆9〇〇系列， 由丙烯酸單聚物與烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯;卡波姆1300系列，為丙烯酸烷基 異丁烯酸共聚物與烯丙基季戊四醇交聯?卡波姆具有高穩定性、生物相容性以及低毒性 的優點，但是作為透皮給藥制劑的載體，具有與皮膚的粘附性差，藥物釋放可控度低的缺 點。因此為了開發蛋白類藥物的透皮給藥制劑，首先需要研究合適的藥物載體。這種藥物 載體在具有優良生物相容性、皮膚粘附性特點的同時，還應具有良好的藥物釋放可控性。 為了能夠直觀地研究蛋白類藥物在載體中的擴散規律，激光掃描共聚焦顯微鏡實時成像 技術與突光漂白恢復（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP)技術1"5]相結合， 被用來開展蛋白藥物在凝膠載體中擴散系數的研究。主要原理是借助高強度脈沖式激光 照射凝膠中的某一區域，從而造成該區域被熒光標記的蛋白發生熒光漂白。然后通過低 強度激光掃描，記錄該區域周圍未漂白的熒光標記的蛋白向被照射區域擴散的速度M. 在本文中，我們合成了低分子量的不同單體配比的系列聚丙烯丑胺-丙稀酸（p(Am-co~ Ac))作為水凝膠藥物載體，應用紅外光譜表征其結構特性?以FITC標記的牛血清白蛋 白（BSA)作為藥物模型分子，通過FRAP實驗，考察FITC-BSA在P(Am-co~Ac)共聚物 凝膠中的擴散行為。通過這些研究，揭示了不同單體配比的P(Am-C〇"Ac)水凝膠對BSA 蛋白擴散的影響，為蛋白質凝膠載體的進一步深入研究提供了科學依據。

 

1實驗部分1.1儀器與試劑儀器：EASYPure LF超純水制取設備（美國Barnsted公司）；Excalibur HE 3100傅 立葉變換紅外光譜儀(美國Varian公司）;Nikon Cl si全光譜激光掃描共聚焦顯微鏡（日 本Nikon公司).

 

試劑：異硫氰酸熒光素(FITC)(北京成文免疫化學研究室）；牛血清白蛋白（RSA)標 準品（中國藥品生物制品鑒定所）；丙烯酰胺（Am)(電化學純度，Acros公司）；丙烯酸 (Ac)(電泳純度，Acros公司，使用前進行純化）；N, N-甲叉雙丙烯酰胺(BIS)(分析純， agma-Aldrich公司）;偶氮二異丁腈(MBAm)(分析純，北京化工試劑廠）；氯化鈉、氯化 鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為分析純試劑，所有實驗用水均為超純水。

 

1.2交聯聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物的制備將丙烯丑胺和N，N-甲叉雙丙烯酰胺(BIS)加入圓底燒瓶中，然后加入30 mL丙酮 使其完全溶解。通人氮氣10 min驅除溶解在溶液中的氧氣?室溫下加入〇。 5%(質量分 數)的引發劑偶氮二異丁腈(MBAm)，繼續通入氮氣10 min后，逐滴滴加丙烯酸溶液。緩 慢升溫至65 °C，反應10 min后，出現白色沉淀。反應持續3 h，停止反應，可觀察到明顯 的白色渾濁溶液。反應完畢后，按100 mL/g的比例，用無水乙醇溶解初產物，攪拌1〇

 

min后抽濾。重復洗滌抽濾5次后，得到白色固體粉末?置于60 X：烘箱中6 h，即得到干 燥的白色粉末。根據單體配比的不同，共制備得到4種不同組成的共聚物。表1列出了 其單體比例。

 

表1制備聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物中丙烯酰胺和丙烯酸比例及其他試劑條件Polymerization conditions of P(Am-co-Ac)copolymersAcrylamideAcrylic acidBISMBAmAcetone (mL)

 

60%40%5%〇2%〇3070%30%5%〇2%〇3080%20%5%〇2%〇3087.5%12.5%5%〇2%301.3聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物的紅外表征將樣品與預先干燥好的KBr(分析純)混合后（樣品與KBr質量比為1 : 100)，于瑪 瑙研缽中研磨均勻，然后壓片制樣?采用Varian 3100 FT-IR Excalibur series紅外分析 儀，對P(Am-C〇~Ac)進行紅外分析。掃描次數為64次，分辨率為2 cm—1，掃描范圍為 400-—4000 cm—1,實驗溫度為 25 °C.

 

1. 4異硫氰酸熒光素標記牛血清白蛋白FITC-BSA的制備按P : F(BSA : FITC) = 8 : 1的比例，將FITC緩緩加入到BSA蛋白溶液中，4 X： 下避光攪拌3 h,經高速離心去除變性蛋白。以Sepheader G~50柱分離，去除游離的 FITC，對FITC標記的BSA分管收集，經分光光度計測定其FITC及BSA蛋白濃度，制 得 FITC-BSA(標記比 Mmr : %脫=1. 75, _ = 15. 12 mg/mL).

 

1.5聚丙烯酰胺-丙烯酸(P(Anw^Ac))凝膠樣品制備pH=7. 4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)配制方法：取 〇。 2044 g KC1，0? 2634 g KH2P04， 8.0044 gNaCl，1.4410gNa2HP〇4 ? 12H20 于 1 L 燒杯中，加入 950 mL 超純水溶解 后，調節pH至7. 4,然后定容至1.0 L.

 

BSA蛋白凝膠樣品制備方法：（1)配制共聚物濃度為1.5 %，FITC-BSA濃度分別為 1 mg/mL, 2 mg/mL，3 mg/mL的水凝膠。（2)將凝膠滴于圓形載玻片上，保證樣品厚度 為50 pm?另外，溫度會影響FITC-BSA擴散速率的測定，因此室溫保持在23 C.

 

1.6應用激光掃描共聚焦顯微鏡進行熒光漂白恢復(FRAP)測定為了研究FITC-BSA在凝膠分子中的擴散系數，使用氬離子激光器，在光斑模式下 (TEM^Mode)在480 rnn的波長下照射載玻片上的FITC-BSA蛋白凝膠樣品?使用20 倍鏡頭觀察樣品。在觀察的區域內選擇直徑為2〇 fxm的圓形區域作為漂白范圍。使用 100%的激光能源在/ = 〇時刻，將光斑內FITC-BSA迅速漂白。然后再次監測漂白區 FITC-BSA的熒光恢復情況，每隔5 s記錄熒光恢復情況圖像。另外，實驗過程中用于監 測掃描的熒光強度選擇在不對樣品熒光產生漂白的強度，為激光器能源的28. 2%.

 

1.7熒光漂白恢復(FRAP)數據分析FRAP的數據分析，采用文獻中提到的用于研究蛋白質在凝膠中的擴散研究公 式[7].在漂白區域內，蛋白的擴散過程由二維擴散方程表示：c(w，t;，f)=c(M，x)，0)exp[—4；T(M2+T/)Z>](1)

 

其中M和是空間頻率?同時，根據Tanke等人先前的研究，焚光蛋白濃度降低所引 起的內部衍射和重吸收可以忽略不計。因此熒光恢復強度則成為時間的一次函數。根據 傅立葉變換，二維擴散方程可變化為：I(u,v,t)=c(.u,v,t)OTF(u,v)(2)

 

其中是某處的熒光強度。再與光學傳遞函數變換結合則熒光恢復方程為：I / I〇=c/c〇 =exp[—4n2qzDt'](3)

 

其中 7〇= KM,取，0)，c〇 =C(M，T;，0)，M2+為擴散系數。由 J//〇對一47r2g2f的線性模擬可求得擴散系數D.

 

2結果與討論2.1聚丙烯酰胺丙烯酸共聚物的制備和表征本實驗中采用水相聚合的方法制備聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物[8]，其目的在于控制聚 合物的分子量?根據文獻中的報道[9]，采用沉淀聚合的方法，可以得到分子量較低的共聚 物?因為在沉淀聚合過程中所使用的有機溶劑丙酮對丙烯酰胺的聚合是很活潑的鏈轉移 劑，且當聚合物的分子鏈增長到一定長度后便會沉淀下來，因而限制了分子鏈的進一步 增長，故所得產物分子量較低[1°].利用該方法合成的聚合物具有溶脹快、粘附性良好的 優點?反應結束后，以乙醇洗滌、抽濾，并以HPLC檢驗濾液中丙烯酰胺(Am)單體的含 量?直至濾液中存在的單體含量小于0.1/xg/mL?為了確定共聚物的組成，我們采用紅 外光譜對聚合物進行分析[11].

 

圖1交聯聚合物P(Am~co>Ac)的紅外譜圖 The FTIR of P(Am-co-Ac) with different [Am]/[Ac] ratios圖1為P(Am-c〇"Ac)聚合物的紅外譜圖。在圖1 PAAM的紅外譜圖中，3345 cm-1 處為丙烯酰胺的一NH2的伸縮振動，3190 cm-1處為酰胺I帶吸收峰，1663 cm—1為羰基伸 縮振動峰，而1613 cm—1處為一NH2的變形振動，這些吸收峰證實了聚丙烯酰胺的特征結 構?而隨體系中丙烯酸含量從〇%逐漸增加到30%時，一NH2的特征吸收峰強度逐漸減 弱，這說明聚合物中丙烯酰胺單體逐漸減少?由于聚合物中丙烯酰胺單體的吸收峰很強， 遮蓋了位于1718 cm—1處的丙烯酸(一COOH)特征吸收峰。當丙烯酸含量從30%增加到 40%的時候，位于1718 cm—1處的丙烯酸特征峰強度逐漸增強和1613 cnT1處一NH2吸收 峰的減弱，證實了聚合物中單體的含量改變。在丙烯酸含量為30%、4〇%的聚合物紅外 譜圖中，可以明顯看到兼有丙烯酰胺和丙稀酸特征的吸收峰。

 

2.2F1TC-BSA濃度對于熒光漂白及恢復的影響FRAP技術是一種基于分子自由擴散的熒光檢測方法。它是一種應用于細胞內熒光 檢測的方法，直到1991年Tsay和Jacobson將FRAP引入到凝膠內分子擴散的研究后， 逐漸成為研究凝膠中分子擴散的最直接、最有效的研究方法L12]?本實驗中選用的牛血清 白蛋白，是一種比較成熟的蛋白模型，常作為模型藥物用于蛋白制劑的研究?通過激光掃 描共聚焦顯微鏡，觀察熒光漂白后FITC-BSA在凝膠中的擴散情況，以便能定性觀察并 且定量地計算FTTC-BSA在凝膠中的擴散系數。實驗中，我們首先考察FTTC-BSA濃度 對于熒光漂白恢復(FRAP)實驗的影響?在480 nm波長處采用不同的激發強度掃描并記 錄圖片，然后采用100%的激光強度對選定的圓形范圍內進行熒光漂白，再使用與漂白前 相同激光強度觀察并記錄漂白區域內的熒光恢復情況（每隔5 s進行一次拍照)?實驗表 明，FITC-BSA濃度為2 mg/mL和3 mg/mL的水凝膠熒光成像清晰，但漂白效果較差， 漂白區域與非漂白區域對比度低。相比之下，1 mg/mL的FITC-BSA,其漂白和成像效果 均較好，能夠得到直觀的漂白恢復過程，因此選擇FITC>BSA的濃度為111^/"^.

 

2.31 mg/mL FITC-BSA熒光漂白恢復的計算結果為了減少FRAP儀器本身帶來的誤差和保證檢驗方法的穩定性，定量測定之前，必 須對熒光恢復的可信度進行驗證，然后再對不同丙烯酸含量共聚物的蛋白質擴散進行定 量分析。因此，首先使用1 mg/mL的FITC-BSA水溶液進行熒光漂白恢復實驗，實驗結 果利用公式(3)計算，1 mg/mL的FITC-BSA擴散系數為6. 8( 土 0. 4) X 10一7 Cm2/S.根 據文獻中的報道[7]，在23 °C時FITC和BSA的擴散系數如下：DFrrc = 26( 士 4)X 10_7 cm2/s，DBSA = 6.〇 (土 4)Xl(T7cm2/s.因此實驗結果表明本研究中建立的熒光漂白恢 復方法和設備測量得到的數據較為可信。表2總結了在不同丙烯酰胺和丙烯酸比例的 P(Arn-caAc)共聚物中FITC-BSA的擴散系數?圖2為FRAP實驗中FITC-BSA在表2 FRAP技術測定P(An?〇"Ac)共聚物中FITC-BSA的擴散系數The diffusion coefficients of FITC-BSA in polyacrylamide-co-acrylic acid gelsAqueous12.5%Acrylic acid ratio20%Acrylic acid ratio30%Acrylic acid ratioA〇%Acrylic acid ratioDiffusion coefficient (X10-7 cm"2/s)6.5( 士 l.〇〇>0.52( 士 0? 19)2.1(士 0.51)0.59( 土 0.07)0.47( 士 0.03)

 

1 mg/mL濃度時的熒光恢復情況?結果表明，P(Am-cc^AC)共聚物單體的組成對BSA 蛋白的擴散系數具有顯著的影響，丙烯酸含量為20%時蛋白質的擴散系數最大。當丙烯 酸含量從12. 5%增加到20%的時候，蛋白質的擴散系數明顯增加?而當丙烯酸含量從圖2 FITC-BSA在不同溶液中的熒光漂白前、漂白后和最后恢復的情況 The FITC-BSA in different solutions before bleaching, after bleaching* and recovering respectively (a)—(c):水溶液中FITC-BSA的熒光漂白前、漂白后和最后恢復的情況;(d)—(f): 12.5%丙烯酸含厘的共聚物中; (g)—(i): 20%丙烯酸含量的共聚物中;(j)—(1): 30%丙烯酸含量的共聚物中；（m)—(〇): 40%丙烯酸含量的共聚物中 (a)—(c)： the FITC-BSA in aqueous solution before bleaching, after bleaching, and recovering respectively, (d)—(f)： the FITC-BSA in polymer(12. 5 %)* (g) — (i)： the FITC-BSA in polymer(20//〇),(j)一（1): The FITC-BSA in polymer(30%)，（m)—(n)： The FITC-BSA in polymer(40%)

 

20%增加到30%直至40%的時候，其中蛋白質的擴散系數又明顯下降。這說明蛋白質的 擴散系數與其中丙烯酸含量有關。丙烯丑胺與丙烯酸單體比例的差異會導致其三維結構 的差別。蛋白的擴散速度與其交聯聚合物的三維結構有關，至于是否與蛋白的電荷有關， 這還需要進一步的研究。

 

3結論通過對FITC-BSA蛋白在聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物中的擴散研究，能夠定性并且 定量分析蛋白的熒光漂白恢復(FRAP)情況。從蛋白擴散系數中可以看出：首先，隨著丙 烯丑胺和丙烯酸比例的變化，FITC-BSA蛋白在共聚物中的擴散系數產生了明顯的變化。 可能是因為交聯共聚物的立體網狀結構發生了改變，從而影響BSA蛋白的擴散系數；其 次，說明熒光漂白恢復(FRAP)技術確實能夠直接而有效地觀察蛋白在凝膠制劑中的擴 散情況，從而為體外篩選蛋白藥物載體提供了新方法。與傳統的體外擴散相比，它具有更 直觀、更簡便的優點。因此，FRAP技術在凝膠藥劑開發這一領域中將具有越來越重要的 應用。最后，FITC-BSA在不同單體比例的聚丙烯酰胺-丙烯酸(P(Am-cc^Ac))共聚物中 的擴散行為不同，表明該共聚物對牛血清白蛋白（BSA)具有優良的釋放控制性，具有潛 在的應用價值。