腈水合酶是一類可以催化腈類物質轉化成相 應酰胺類物質的酶，主要應用于催化水合丙烯腈生產丙烯丑胺。丙烯酰胺是一種用途廣泛的精細 化工產品，主要用于制造均聚物或共聚物，廣泛應 用于石油開采、造紙、廢水處理、冶金、食品和化工 等領域：3’4]。微生物法生產丙烯酰胺的技術關鍵在 于保證微生物轉化過程中腈水合酶的高效性和穩 定性，采用游離酶或微生物生產丙烯酰胺具有一定 的不穩定性，在熱、酸、堿及有機溶劑存在的條件 下，腈水合酶的活性極易降低甚至喪失；而采用微 生物固定化技術能有效提高腈水合酶的穩定性并 可反復使用，具有一定的優越性。
腈水合酶產生菌株的固定化在我國一般采用海藻酸鈉包埋法，在日本主要采用聚丙烯酰胺 (PAM)凝膠包埋法[5]。利用海藻酸鹽固定化微生 物具有制備方法簡單、酶活力損失少、生物毒性小 等優點，但其機械強度較低，而且在含有多價陰離 子以及高濃度電解質的溶液中不穩定，特別是在磷 酸鹽體系中，固定化細胞易破碎;6’7]。PAM固定化 法的優點是化學性能穩定、機械強度高，缺點是固 定化細胞成型性和可控性不佳?。
本工作采用海藻酸鈉（SA)和PAM兩種固定 化載體對腈水合酶產生菌株進行固定化，優化了固 定化條件，以期獲得更適宜于腈水合酶產生菌株的 固定化載體并提高腈水合酶的穩定性。
1實驗部分1.1菌種腈水合酶產生菌株燦sp. HUST -3 由哈爾濱理工大學微生物實驗室分離篩選并保藏。 1.2固定化細胞的制備1.2.1PAM固定化法將一定量的腈水合酶產生菌細胞、丙烯酰胺、 交聯劑-甲叉雙丙烯酰胺（BIS)和水配成混 合液，攪拌下滴入2 mL引發劑過硫酸銨和1 ~2滴 催化劑四甲基乙二胺，在冰水浴中靜置聚合成凝膠 狀。在4 t下固定化6 h后將凝膠用手術刀切成 3 mm3的立方體膠粒，用蒸餾水反復洗滌后濾干，即 得PAM固定化細胞顆粒。
1.2.2SA-PAM聯合固定化法分別將質量分數3. 5%的SA溶液與不同質量 分數的PAM溶液、質量濃度1 g/L的腈水合酶菌懸 液(簡稱菌懸液）按體積比20: 1“=0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0)混合均勻，用醫用注射器將 上述混合液平穩滴人到質量分數4%的CaCl2溶液 中形成小球;在4 t下固定化6 h，濾出小球，用蒸餾 水反復洗滌后置于不同質量分數的交聯劑戊二醛 溶液中交聯20 min,即得SA - PAM固定化細胞 小球。
1.3酶活力的測定游離態細胞酶活力的測定：按GB 12005.3—89 《聚丙烯酰胺中殘留丙烯酰胺含量測定方法——溴 化法》測定。本實驗所使用的游離態細胞的酶活力為 1 305.64 U。
固定化細胞酶活力的測定：與游離態細胞酶活 力的測定方法相同，只是將反應體系的體積擴大為 原體積的5倍，菌懸液體積為包含相同生物量的固 定化細胞小球體積。
相對酶活：相同菌懸液濃度的固定化細胞酶活 力與游離態細胞酶活力的比值。
1.4固定化細胞機械強度的測定挑選100個大小均勻的固定化細胞顆粒，放于 500 mL 燒杯中，加水 100 mL,以 500 ~ 3 000 r/min 的攪拌轉速攪拌5 min,觀察顆粒的直徑變化和破 損情況。機械強度為未破損顆粒個數與總顆粒個 數的比值。
2結果與討論2.1 PAM固定化法2.1.1細胞加入量對相對酶活的影響細胞加入量對相對酶活的影響見圖1。從圖1 可看出，隨細胞加人量的增大，相對酶活先提高后 降低，當細胞加人量為5 g/L時，相對酶活最高，達 48. 8%;繼續增大細胞加人量則相對酶活降低。因 此，最佳細胞加人量為5 g/L。
2.1.2丙烯酰胺加入量對相對酶活的影響丙烯酰胺加入量對相對酶活的影響見圖2。由 圖2可知，隨丙稀酰胺加入量的增大，相對酶活先提 高后降低，當丙烯酰胺加入量為180 g/L時，相對酶 活最高，達56.7% ;繼續增大丙烯酰胺加人量則相對 酶活降低。因而，最佳丙烯酰胺加人量為180 g/L。
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2010年第39卷2.1.3BIS加入量的影響BIS加人量對相對酶活和固定化細胞機械強度 的影響見表1。從表1可知，BIS加入量對固定化細 胞的機械強度影響較大而對相對酶活影響較小，當 BIS加入量小于7 g/L時，隨BIS加人量的增加，固 定化細胞的機械強度迅速增大而相對酶活小幅度 提高；當BIS加入量大于7 g/L時，隨BIS加人量的 增加，固定化細胞的機械強度保持最高而相對酶活 開始降低。因此最佳BIS加人量為7 g/L，此時固 定化細胞的機械強度和相對酶活最髙，分別為90% 和 60.7%。
表1 BIS加入量對相對酶活和固定化細胞機械強度的影響 Table 1 Effect of BIS dosage on relative enzyme activity and mechanical strength of the immobilization cellBIS dosage/ (g * L "1) E{/E,% Mechanical strength,%355.130457.450557.150659.670760.790858.390957.2901054.690Immobolization conditions： AM dosage 60 g/L, cell dosage5g/L, 4 t：？6h.
Reaction conditions referred to Fig. 1.
2.2 SA-PAM聯合固定化法PAM具有增稠作用與靜電吸附效應，與SA制 成復合載體可以增強凝膠強度，減少細胞流失，并 且提高固定化細胞的穩定性。
2.2.1PAM溶液質量分數對相對酶活的影響 PAM溶液質量分數對相對酶活的影響見圖3。
由圖3可看出，隨PAM溶液質量分數的增大，相對 酶活先提高后降低，當PAM溶液質量分數達到6% 時，相對酶活最高，為82.3%。同時在實驗過程中發 現，當PAM溶液質量分數低于4%時，固定化細胞的 機械強度較差，反應過程中細胞容易溶解;當PAM溶 液質量分數超過6%時，溶液過于黏稠，制成的固定 化小球有脫尾現象;當PAM溶液質量分數為4% ~ 6%時，固定化細胞的成型性最好。故最佳PAM溶 液質量分數為6%。
2.2.2PAM溶液與菌懸液體積比對相對酶活的 影響PAM溶液與菌懸液體積比對相對酶活的影響 見圖4。從圖4可見，當PAM溶液與菌懸液的體 積比為1.5 : 1時相對酶活最高。已知SA與菌懸 液的最優體積比為20 : 1，因此在SA - PAM聯合 固定化法中，SA溶液、PAM溶液與菌懸液的最佳 體積比為20 : 1. 5 : 1，此時相對酶活最高，為 85. 2% 02.2.3戊二醛溶液體積分數對相對酶活的影響 交聯劑戊二醛能使酶蛋白分子間產生交聯作 用，凝集成網狀結構，從而提高固定化酶的酶活力 和強度~ ;同時戊二醛又是一種酶變性劑，經它處 理過的固定化細胞的酶活力損失較大，因此考察了 戊二醛溶液體積分數對相對酶活的影響，實驗結果 見圖5。
由圖5可看出，隨戊二醛溶液體積分數的增加， 相對酶活逐漸提高，這說明戊二醛的交聯作用起主 導作用。當戊二醛體積分數大于2%時，相對酶活 大幅度下降，這證明戊二醛是一種酶變性劑，用量 過多會導致細胞失活。同時在實驗過程中發現，經 戊二醛交聯后細胞的機械強度明顯增強，因此確定 戊二醛的最佳體積分數為2%，此時相對酶活最高， 為 92.1%。
2.3SA-PAM聯合固定化細胞的重復使用次數 對相對酶活的影響SA - PAM聯合固定化細胞的重復使用次數對 相對酶活的影響見表2。由表2可見，SA-PAM聯 合固定化細胞在重復使用9次后，相對酶活仍保持 在50%以上，而PAM固定化細胞只能進行1次反 應。由此可見，SA-PAM聯合固定化細胞具有更 高的操作穩定性。 表2 SA - PAM聯合固定化細胞的重復使用次數對相對酶活的影響Table 2 Effect of reuse times of SA-PAM co-immobilization cells on relative enzyme activityReuse timesEx/E,%Reuse timesReuse times E^E,%192.7477.6762.4286.7568.3857.9379.5664.3950.1Immobolization conditions； p(cell) =1 g/Lf vv(SA) =3.5%, w(PAM) =6%, V(SA) ： K(PAM) ： V (ceU) = 20 ： 1. 5 ： 1, <p( glutaraldehyde) =2% , 4 t, 6 h.
Reaction conditions referred to Fig. 1,3結論(1)PAM固定化法的最佳條件為：細胞加入量 5 g/L、丙烯酰胺加入量180 g/L、BIS加人量7 g/L、 4 t下固定化6 h,此時相對酶活最高（為60.7%); SA -PAM聯合固定化法的最佳條件為：SA溶液質 量分數3.5%,菌懸液質量濃度1§/1^？八\1溶液質 量分數6%，SA溶液、PAM溶液與菌懸液的體積比 20 : 1.5 : 1，交聯劑戊二醛的體積分數2%,4 t下 固定化6 h,此時相對酶活最高（為92. 7%)。相同 反應條件下，SA-PAM聯合固定化細胞的相對酶 活高于PAM固定化法。
(2)SA-PAM聯合固定化細胞在重復使用9 次時，相對酶活仍為50. 1%，說明SA -PAM聯合 固定化的腈水合酶具有較高的穩定性。