高效毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE)對蛋白質、多肽及其它生物大分子樣品的高分離效 率使其在蛋白組學研究中具有很大的應用前景.CE分析堿性蛋白時存在的主要問題是未處理的石英 毛細管壁殘留的硅羥基與帶正電荷的堿性蛋白質形成不可逆吸附，使譜帶展寬，峰托尾，交聯(lián)聚丙烯酰胺毛細管電泳涂層柱的制備及其應用，分離重現(xiàn)性 顯著降低[1].解決該問題的方法主要有動態(tài)去活法、壁涂層法和極端pH法等，其中以壁涂層法應用 最為普遍.涂層技術可采用物理吸附[2’3]或化學鍵合兩種方式，其中物理吸附技術（如甲基纖維素或者 聚乙烯亞胺等）制柱簡單，但穩(wěn)定性及重現(xiàn)性較差.化學鍵合涂層（如線性聚丙烯酰胺[4]，交聯(lián)聚丙烯 酰胺[5~9]等）在毛細管表面形成一層永久性涂層，能夠有效地降低電滲流，減少蛋白的吸附，具有較好 的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性.

本文發(fā)展了一種制備交聯(lián)聚丙烯酰胺毛細管柱涂層技術，該涂層可有效地抑制電滲流，具有較好 的分離重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

丙烯酰胺（Amresco)、甲叉基雙丙烯酰胺（Bis)( Amresco)、過硫酸按（Amresco)和！"-四

甲基乙二胺（TEMED)(Sigma公司）未進一步處理，直接使用；石英毛細管（50 !mi. d. X 350 !m o.d.)購自河北永年光導纖維廠；溶菌酶和核糖核酸酶A購自Sigma公司；細胞色素C購自Merck公 司；3-(三甲氧基硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯（y-MAPS，純度98%)購自美國Acros公司；甲醇和乙腈為 色譜純（Fluka公司）.乙酸、丙酮、二甲亞砜（DMSO)、硼酸和磷酸二氫鉀等均為分析純，實驗用水為 “娃哈哈”純凈水.

實驗室自組裝毛細管電泳儀，JascoCE-1575紫外檢測器（JASCO公司）毛細管(40cm/34cm，總 長/有效）；KH2PO4緩沖液（0. 02 mol/L，pH=4. 0);分離電壓 10 kV;虹吸進樣 10 cmx15 s; Chrom- perfect 工作站（Micro-Tech. Scientific Inc.).

所有實驗均在室溫下操作.

1.2生物堿樣品（麻黃提取物）的制備

將干燥的麻黃藥材（購自大連美羅大藥房）用粉碎機粉碎過篩，交聯(lián)聚丙烯酰胺毛細管電泳涂層柱的制備及其應用，準確稱取該粉末1.0 g，加入30 mL 甲醇，超聲提取30 min,冷卻后離心15 min(3 000 r/min)，移取上清液，補充溶劑損失，使其體積達到30 mL.將上述樣品溶液用純水稀釋，用0.45 !m微孔濾膜過濾后，將樣品儲存于4 C冰箱中備用. 1.3毛細管電泳柱的制備

毛細管柱的預處理采用文獻[5]方法，稍作改進.先用0.1 mol/LNaOH清洗毛細管內壁1 1用純 凈水沖洗1h，然后用50倍柱體積丙酮清洗.將處理后的毛細管放入氣相色譜爐箱內，在140 C通氮 氣干燥5 h.將含體積分數為66%的y-MAPS和0. 3%乙酸的乙腈溶液注入到該毛細管中，在50 C水 浴中反應12 h.然后用丙酮沖洗1 h，在140 C通氮氣干燥5 1備用.

聚合反應裝置采用一個3 mL樣品瓶，樣品瓶的瓶蓋經特殊加工（能耐0.3 MPa的壓力），蓋上有4 個孔（分別為氦氣進口、通氣口、毛細管進口和進樣針口）.首先將質量分數為3% ~4%的丙烯酰胺和 0. 008% ~0. 03%的甲叉基雙丙烯酰胺的混合液加入到樣品瓶中，將處理后的毛細管插入到樣品瓶中 液面之上，通入氦氣除氧約30 min后，向該混合液中先后加入1. 0 !L TEMED和1. 0 !L過硫酸銨（質 量分數為10%)，在氦氣流下迅速混勻.將毛細管快速插入到聚合液內，在毛細管末端可以看到聚合 液不斷流出.8 min后取出毛細管，用純凈水沖洗，然后在120 C用氮氣吹30 min.

1.4電滲流測定

以電中性的二甲亞砜（DMSO)為標記物，測定不同制柱條件下的電滲遷移時間來評價涂層的制備 效果.緩沖溶液為0.002 mol/L硼酸（pH =9.0)，毛細管內徑50 !m,長40 cm,檢測窗距陽極6. 0 cm. 檢測波長214 nm,電壓250 v/cm.陽極為含2 !L/mL DMSO的緩沖液，陰極為緩沖液，調整毛細管兩

端高度相同.電滲流用電滲淌度(h。）表示，計算方法如下：

弘 eo = #e〇/!(1)

#eo = "/$eo(2)

式中，"為毛細管有效長度，$e。為DMSO的遷移時間，！為電場強度.

1.5 實驗方法

堿性蛋白用純凈水溶解，配制成5.0 mg/mL的儲備液，然后用水稀釋到所需濃度.緩沖溶液為 KH2PO4(pH=4.0, 0. 02 mol/L)，分離電壓 250 v/cm，檢測波長 214 nm.

麻黃提取物分離條件與堿性蛋白相同，麻黃提取物檢測波長210 nm.

2結果與討論

丙烯酰胺的聚合反應屬于自由基鏈式反應，分子氧具有顯著的阻聚作用，氧與自由基反應形成不 活潑的過氧自由基，阻止了鏈的延長，形成分子量較低的聚合物，不能有效地屏蔽管壁的硅羥基.因 此，去除聚合液中的氧是涂層過程中的關鍵，采用本文的聚合裝置不僅可以完全去除聚合液中溶解的 氧，而且可以防止在聚合過程中氧氣的再溶解.另外，丙烯酰胺開始聚合后，聚合液粘度迅速增加，采 用本文的聚合裝置可以迅速將聚合液壓入預處理的毛細管內，從而使溶液聚合以及與管壁雙官能團試 劑的聚合同時進行.

2.1毛細管預處理方法對制柱的影響

對毛細管采用了兩種不同預處理方法，對所制備的涂層柱（單體質量分數為4%，交聯(lián)劑質量分數 為0. 015% )的電滲流進行了比較.參照文獻[4 ]方法，硅烷化反應采用體積分數為0. 4%的y-MAPS和 0.3%乙酸的乙腈溶液，于室溫下反應12 h，測得電滲流為3.2X10-9 m2 • V-1 • S-1.而采用含體積分 數為66%的y-MAPS和0.3%乙酸的乙腈溶液的硅烷化試劑[5]，在50 C水浴中反應12 h，測得電滲流 為6.67 x10-10m2 • V-1 • S-1.通過比較可以發(fā)現(xiàn)，硅烷化反應適合于在較高溫度以及高濃度下進行， 因此本實驗采用第二種方法進行毛細管預處理.

2.2電滲流的測定

表1為所制備的涂層柱與未涂層柱的電滲流對比結果.可見，交聯(lián)聚丙烯酰胺毛細管電泳涂層柱的制備及其應用，與未涂層柱相比，采用交聯(lián)聚丙烯 酰胺涂層可以有效地抑制電滲流.另外，交聯(lián)劑的濃度對結果影響顯著，當交聯(lián)劑濃度較大時，所得 涂層較厚，可以有效地屏蔽管壁的硅羥基.例如，表1中第4組毛細管的電滲流最小（下降到1/300)， 但采用該配比的聚合溶液容易造成毛細管堵塞，因此后續(xù)實驗采用第二組聚合液配比.

Table 1 EOF from coated capillaries with different compositions

Coating!l2345( Uncoated)

(Acrylamide )( % )4444

![ Bis( cross-linker) )( % )0. 0080. 0l50. 020. 03

l09!eo/)m2 • V-1 .s_”3.390.670. 490. 3397

! The coating time for all coated columns were 8 min. The background electrolyte for EOF measurements was 0. 002 mol/L H3BO3.

2.3分離堿性蛋白

在pH =4.0的0.02 m〇l/L磷酸鹽緩沖液中，對3種堿性蛋白質進行了分離，結果如圖l所示.3

種蛋白質在l5 min內得到了很好的分離，譜帶尖銳 且無拖尾現(xiàn)象.進行多次樣品測定后柱效無明顯降 低，表明該涂層能夠有效地抑制堿性蛋白質在毛細 管壁的吸附（見表2).

Table 2 Reproducibility of migration time and separation efficiency obtained on polyacrylamide-coated capillaries for basic proteins

ColumnReproducibilityC RSD, % ) ( # =5 )

Proteinefficiency (l05plates/m)Run to runDay to dayColumn to column

Cytochrome C3.62l.53.24.5

Lysozyme3.20l. 83. 55. l

Ribonuclease A5.432. l5.26.0

2.4分離生物堿

CE作為一種快速、高效的分離分析技術，已經在黃酮以及生物堿類化合物的分離分析方面得到 廣泛應用.由于涂層柱能夠有效地降低電滲流，因此可以在普通的磷酸緩沖溶液中分離生物堿類化合 物，而不必采用復雜的緩沖體系^?^及煩瑣的分離優(yōu)化步驟，可大大簡化生物堿類化合物的分離.

采用磷酸緩沖體系，分別在涂層柱以及未涂層柱中對麻黃提取物進行了電泳分離.在未涂層毛細 管中，采用磷酸緩沖體系分離麻黃提取物時，峰變寬嚴重，其中的4個組分無法有效分離[見 圖2(A)].而在聚丙烯酰胺涂層柱中，在完全相同的條件下，4個組分達到了基線分離[見圖2(B)]， 且柱效提高l0倍，平均分離柱效為2. 4 X l05plates/m.

Fig. 2 Electropherograms of Ephedrae extract separation on uncoated columnC A) and coated columnC B)

2.5涂層的穩(wěn)定性

為考察涂層柱的穩(wěn)定性，取兩組涂層柱進行對照實驗，一組涂層柱用純凈水沖洗30 min,另一組 依次用0.0l mol/L氫氧化鈉水溶液、純凈水分別沖洗l5 min,然后進行相同次數的樣品測定，在每天 實驗后測定這兩組毛細管柱的電滲流，實驗完畢后沖入純凈水儲存，結果見圖3.

實驗結果表明，用純凈水沖洗后的涂層柱比較穩(wěn)定，交聯(lián)聚丙烯酰胺毛細管電泳涂層柱的制備及其應用，在實驗過程中電滲流變化幅度較小.而用氫 氧化鈉沖洗后的涂層柱，在實驗過程中電滲流迅速增加，在5 d后電滲流接近于未涂層柱.這可能主 要是由于聚丙烯酰胺涂層與毛細管壁通過 Si—O—Si—C鍵鍵合的，Si—O—Si—C鍵在喊 性條件下易于水解，從而使聚丙烯酰胺涂層部分 脫落，露出管壁的硅羥基，導致電滲流迅速增 加.

2.6 結論

本文建立的涂漬交聯(lián)技術所制備的涂層柱能 夠有效地抑制堿性蛋白質在毛細管壁的吸附，具 有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性.將該類涂層柱用于中 藥生物堿類樣品的電泳分離，平均柱效大于 2. 4 X 105 plates/m.