聚丙烯釀胺水凝膠中丙烯釀胺單體的提取及高效液相色譜測定:

聚丙烯釀胺水凝膠中丙烯釀胺單體的提取及高效液相色譜測定前言和文獻回顧

聚丙烯酰胺水凝膠（Polyacrylamide Gel，PAMG)自1997年由烏克蘭及

俄羅斯引入我國后，在整形外科廣泛應用于注射隆乳術，后因出現硬結、移 位、疼痛、炎癥等多種并發癥，國家食品藥品監督管理局于2006年4月全面 禁止聚丙烯酰胺水凝膠在整形外科的應用。據估計，到目前為止我國有超過 30萬人接受了聚丙烯酰胺水凝膠注射隆乳，而產生眾多并發癥的原因仍不確

定。

醫用聚丙烯酰胺水凝膠是由丙烯酰胺（acrylamide，AM)單體與N,N’- 亞甲基雙丙烯酰胺（N,N’-methylenebisacrylamide，BIS)作為交聯劑共聚后

與大量水溶脹而成的水凝膠狀物，本身沒有毒性，但其聚合原料丙烯酰胺對 人體有神經毒性及可能的生殖毒性、致癌性。聚丙烯酰胺水凝膠在農業中作 為高吸水性材料可用作土壤保濕劑，有研究表明土壤中的聚丙烯酰胺水凝膠 可以發生一定的降解，而生物組織中復雜的環境與土壤有一定的類似性，因 此考慮其在人體中有可能發生降解。因為聚丙烯酰胺水凝膠本身的結構特性 致使對其的化學檢測方法有限，對其含有的化學成分的提取成為關鍵。以往 對其的檢測方法缺乏科學性。近年來在食品行業中，食品中的丙烯酰胺含量 受到關注，已經建立了多種成熟的丙烯酰胺檢測方法。國內雖已有報道從并 發癥患者體內取出的聚丙烯酰胺水凝膠中檢測到丙烯酰胺單體，然而未給出 具體的檢測方法[1]。

本課題將對聚丙烯酰胺水凝膠中丙烯酰胺單體的提取及檢測方法進行研

究。

以下對本課題相關研究進展進行文獻回顧。

1聚丙烯酰胺的化學特性及應用 1.1聚丙烯酰胺及丙烯酰胺的化學特性

聚丙烯酰胺由丙烯酰胺單體在引發劑作用下均聚或共聚而成，形成一系 列產品，主要有非離子型、陰離子型、陽離子型、交聯型。非離子型由丙烯 酰胺均聚而成，陰離子型由丙烯酰胺均聚后水解而成或由丙烯酰胺和丙烯酸 共聚而成，陽離子型由丙烯酰胺與乙烯基陽離子單體共聚而成，交聯型由丙 烯酰胺和N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺作為交聯劑共聚而成[2]。

丙烯酰胺是一種白色無味的晶狀固體，熔點84.5°C[3]，可溶于多種極性 溶劑，包括丙酮、乙腈、水等。30°C，lOOmL水可以溶解215.5g丙烯酰胺。 丙烯酰胺有兩個重要的功能基團，C = C烯鍵和氨基。C = C烯鍵因為缺電子 而使丙烯酰胺易于發生多種化學反應，包括親核加層反應、Diels-Alder反應、 自由基反應[4]。因此，氨、脂肪胺、磷化氫、氯、溴、亞硫酸鹽均可與C = C 烯鍵發生反應。氨基的反應包括水解、脫水、醇解、醛濃縮[5]。

丙烯酰胺是一種急性的眼、皮膚、呼吸道刺激物，可以通過多種途徑被 人體吸收，包括靜脈、腹膜、皮下、肌內、口腔、皮膚等。丙烯酰胺的毒性 已經過充分的研究，記載于多篇文獻中[6_8]。

高等動物一旦吸收丙烯酰胺，將導致中樞神經系統的損傷，產生上行性 中央或周圍神經病。這種神經病波及神經的長度和程度取決于中毒的水平， 通常以周圍和脊髓的上行束的感覺、運動、自主神經的功能破壞為標志。丙 烯酰胺已被美國環保局（U. S. Envirnment Protection Agency, EPA)歸類為B2 類疑似致癌物，即有充足的動物致癌證據但缺乏足夠的人類致癌證據[9]。

丙烯酰胺可被有機體代謝為多種化合物并排泄。Dearfield等[1()]最近的研 究表明丙烯酰胺的一些代謝產物表現出誘發基因突變的特性。例如，丙烯酰 胺雙鍵氧化形成一種相對穩定的環氧衍生物一環氧丙酰胺（Glycidamide)。 環氧丙酰胺可誘發沙門氏菌的基因突變，并認為可能對其他測定系統有廣泛 的基因突變作用[1()]。因此，在評價丙烯酰胺毒性的時候，評價丙烯酰胺的代 謝及降解產物的毒性也很必要。

雖然有大量關于丙烯酰胺對動物的毒性文獻，但是由于缺乏人類的研究 數據而難以確定丙烯酰胺的安全暴露濃度。在丙烯酰胺毒性的研究中習慣用 ppm (10_6)來表示丙烯酰胺的濃度。動物實驗結果為丙烯酰胺無可見作用劑 量（NOEL)為0.2?2ppm，最低可見作用劑量（LOEL)為1?3ppm。需要建 立一種假設來把動物實驗的數據轉換為適于人類的劑量。一般公認的人類可 接受劑量為動物水平的1/1000。因此，美國環保局規定丙烯酰胺的安全暴露 劑量為 〇.3ppb (1〇-9) [7]。

丙烯酰胺的聚合方式使得聚丙烯酰胺與丙烯酰胺的化學及生物特性完全 不同。丙烯酰胺由于有缺電子的c=c雙鍵，成為一種活潑的化合物，而丙烯 酰胺的聚合使雙鍵變為單鍵，因此在通常情況下，聚丙烯酰胺的化學特性相 對不活潑[4]。由于聚丙烯酰胺只有C一C單鍵而無法像丙烯酰胺一樣發生親 核加層反應。聚丙烯酰胺的氨基仍可以進行水解、脫水反應。

由于聚丙烯酰胺的某些應用與人或動物有直接接觸，因此聚丙烯酰胺是 否有毒性受到人們的關注。聚丙烯酰胺的毒性問題自從20世紀50年代就被 廣泛研究，如厘^：〇11紐紅等[11]研究聚丙烯酰胺的攝取毒性。他們通過給大鼠 和狗服用聚丙烯酰胺進行了急、慢性毒性實驗，大體及病理檢查均未發現毒 性表現。在高達6000ppm的劑量下對魚進行的毒性實驗同樣未發現明顯的毒 性。McCollister早期的實驗結果被很多學者證實[5?1]。如Seybold[12]得出結 論：聚丙烯酰胺對人類、哺乳動物、魚類、植物均無毒性作用。

1.2聚丙烯酰胺的應用

聚丙烯酰胺（PAM)是丙烯酰胺單體在引發劑作用下均聚或共聚所得聚

合物的統稱，是水溶性高分子材料中應用最廣泛的品種之一，在石油開采、 水處理、紡織印染、造紙、選礦、洗煤、醫藥、制糖、養殖、建材、農業等 行業具有廣泛的應用，有“百業助劑”、“萬能產品”之稱[13]。

1997年報道世界年總需求量為65萬噸，年需求增長率為10%[14]。早在 1893年，德國科學家Moureu首先合成聚丙烯酰胺，1952年美國道化學公司 獲得了聚丙烯酰胺的專利權，并于1954年開始工業化生產。我國于1966年 在蘭州白銀有色金屬公司建立了國內第一條聚丙烯酰胺生產線。2005年，我 國市場需要聚丙烯酰胺共14.2萬噸[15_17]。

1.2.1水處理領域

聚丙烯酰胺在水處理工業中的應用主要包括原水處理、污水處理和工業 水處理3個方面。在原水處理中，聚丙烯酰胺與活性炭等配合使用，可用于 生活水中懸浮顆粒的凝聚和澄清；在污水處理中，聚丙烯酰胺可用于污泥脫 水；在工業水處理中，聚丙烯酰胺主要用作配方藥劑。在原水處理中，用有 機絮凝劑聚丙烯酰胺代替無機絮凝劑，即使不改造沉降池，凈水能力也可提 高20%以上。所以目前許多大中城市在供水緊張或水質較差時，都采用聚丙 烯酰胺作為補充。在污水處理中，采用聚丙烯酰胺可以增加水回用循環的使 用率間。

1.2.2石油采油領域

在石油開采中，聚丙烯酰胺主要用于鉆井泥漿材料以及提高采油率等方 面，廣泛應用于鉆井、完井、固井、壓裂、強化采油等油田開采作業中，具 有增粘、降濾失、流變調節、膠凝、分流、剖面調整等功能。目前我國油田 開采已經步入中后期，為提高原油采收率，目前主要推廣聚合物驅油和三元 復合驅油技術。通過注入聚丙烯酰胺水溶液，改善油水流速比，使采出物中 原油含量提高。目前國外聚丙烯酰胺在油田方面的應用不多，我國由于特殊

的地質條件，大慶油田和勝利油田已經開始廣泛采用聚合物驅油技術[19]。 1.2.3造紙領域

聚丙烯酰胺在造紙領域中廣泛用作駐留劑、助濾劑、均度劑等。它的作 用是能夠提_紙張的質量，提_楽■料脫水性能，提_細小纖維及填料的留著 率，減少原材料的消耗以及對環境的污染等。聚丙烯酰胺在造紙中使用的效 果取決于其平均分子量、離子性質、離子強度及其它共聚物的活性。非離子 型聚丙烯酰胺主要用于提高紙漿的濾性，增加干紙強度，提高纖維及填料的 留著率；陰離子型共聚物主要用作紙張的干濕增強劑和駐留劑；陽離子型共 聚物主要用于造紙廢水處理和助濾作用，另外對于提高填料的留著率也有較 好的效果。此外，聚丙烯酰胺還應用于造紙纖維回收[2()]。

1.2.4紡織印染工業

在紡織工業中，聚丙烯酰胺作為織物后處理的上漿劑、整理劑，可以生 成柔順、防皺、耐霉菌的保護層。利用它的吸濕性強的特點，能減少紡細紗 時的斷線率；聚丙烯酰胺作后處理劑可以防止織物的靜電和阻燃；用作印染 助劑時，聚丙烯酰胺可使產品附著牢度大、鮮艷度高，還可以作為漂白的非 硅高分子穩定劑；此外，聚丙烯酰胺還可以用于紡織印染污水的高效凈化[21]。 1.2.5其他領域

在采礦、洗煤領域，采用聚丙烯酰胺作絮凝劑可促進采礦、洗煤回收水 中固體物的沉降，使水澄清，同時可回收有用的固體顆粒，避免對環境造成 污染；在制糖工業中，聚丙烯酰胺可加速蔗汁中細粒子的下沉，促進過濾和 提高濾液的清澈度；在養殖工業中，聚丙烯酰胺可改善水質，增加水的透光 性能，從而改善水的光合作用；在醫藥工業中，聚丙烯酰胺可用作分離抗菌 素的絮凝劑、用作藥片的賦型粘接劑以及工藝水澄清劑等；在建材工業中， 聚丙烯酰胺可用作涂料增稠分散劑、鋸石板材冷卻劑以及陶瓷粘接劑等；在 農業上，聚丙烯酰胺作為高吸水性材料可用作土壤保濕劑以及種子培養劑等。 在建筑工業中，聚丙烯酰胺可以增強石膏水泥的硬度，加速石棉水泥的脫水 速度。此外，聚丙烯酰胺還可用作天然或合成皮革的保護涂層以及無機肥料 的造粒助劑等[13_14a6_17]。

2聚丙烯酰胺水凝膠在整形外科中的應用及出現的并發癥

醫用聚丙烯酰胺水凝膠是交聯型聚丙烯酰胺與大量水溶脹而成的水凝膠 狀物。其結構、性質類似于實驗室中電泳用的聚丙烯酰胺凝膠，后又經過多 種雜質的去除工藝，使丙烯酰胺單體含量降到0.5)ig/g以下[22]。

聚丙烯酰胺水凝膠在整形外科中的應用始于1967年，前蘇聯基輔的醫生 用少量的線性聚丙烯酰胺進行歌唱家聲帶的矯正；1971年在線性聚丙烯酰胺 的基礎上又研制出軟接觸晶體，廣泛應用于近視眼的矯正，一直延用至今； 1983年開始用于治療陽萎的陰莖局部注射，并正式把聚丙烯酰胺膠狀聚合物 命名為“英捷爾法勒”，在1987年以后，“英捷爾法勒”被廣泛、大量地應用 于面部、乳房、四肢及男女性器官的填充修復[23]。1997年12月，聚丙烯酰 胺水凝膠（英捷爾法勒）正式引入我國，應用于整形外科[24]。1999年，醫用 聚丙烯酰胺實現了國產化（商品名為奧美定），并大量投入市場，根據廠家提 供的銷售資料不完全統計，至今我國已有超過30萬的婦女接受了該類材料的 注射（也有人估計超過50萬）。因為操作簡單、痛苦小，該方法備受患者和 許多美容院的歡迎。但隨著時間的推移，臨床上出現了一些并發癥，主要有: 感染、血腫、硬結、增生、無菌性炎癥、胸大肌炎、持續疼痛、注射物移位、 破潰及滲漏等。生產廠家和部分學者認為并發癥是從業人員操作不規范所造 成的，但也有學者認為有一些問題單純用操作失誤無法解釋，如所謂無菌性 炎癥的發生原因并不十分明了，某些患者出現乳房反復破潰（有的患者超過 10次），而細菌培養為陰性，難以用普通并發癥解釋，也有患者出現持續難 忍的疼痛，但原因不明。由于各種原因而取出的充填物的物理性狀發生了改 變，植入時為無色、透明、均勻一致和彈性很好的凝膠狀物質，而從人體抽 出時顏色呈淡黃色、顆粒狀、失去了粘彈性，而合并感染者抽出的充填物外 觀如食糜樣。由于上述原因，自從該材料引入我國之后，其安全性一直倍受 學術界的關注和質疑，更有部分學者強烈反對其應用[25_27]。后因社會反響強 烈，國家食品藥品監督管理局于2006年4月全面禁止聚丙烯酰胺水凝膠的在 整形外科的應用。

3液相色譜分析樣品前處理技術

樣品前處理包括樣品的采集、萃取、凈化和濃縮。萃取與凈化是其主要 環節。而萃取與凈化方法常常交織在一起。

萃取的目的是將目標物從樣品中轉移至溶液。根據樣品的成分、水分和 脂肪含量、目標物的理化性質和在樣品中的存在形式，選擇不同萃取溶劑和 萃取方法。萃取原則是從樣品中盡可能完全地萃取出目標物，盡量少萃取出 干擾測定的共萃取物。常用萃取方法如下。

3.1索式萃取

索式萃取法（Soxhlet Extraction)系樣品通過連續循環回流萃取，萃取回 收率高，是一種經典的萃取方法。在建立新方法時，常用這種萃取方法作為 對照方法。適用于低揮發性、熱穩定性分析物的萃取。它的優點是：（1)新 溶劑不斷與樣品接觸從而使分析物溶于溶劑而萃取出；（2)維持相對較高的 萃取溫度；（3)不需要進一步離心或過濾；（4)操作簡單經濟。缺點：（1) 萃取時間較長；（2)需要消耗大量溶劑、冷卻水；（3)不能在萃取過程中攪 拌以加速萃取；（4)因為用了大量的溶劑，而需要進一步濃縮處理；（5)由 于長時間處于萃取劑的沸點溫度，分析物可能會分解[28]。近幾年出現在市場 上的自動索式萃取器克服了傳統索式萃取的部分缺點，萃取時間明顯縮短，

結果的可重復性與傳統法相當[29]。目前這種新方法已被廣泛應用于植物、食 品中脂類、多環芳香類化合物的檢測[29_3()]。

3.2超聲波萃取

樣品加溶劑進行超聲波萃取是一種有效的萃取方法。超聲波攪拌使固- 液接觸更密切，而產生的和緩的加熱有助于萃取過程的進行。將細顆粒狀樣 品置于瓶中，加入溶劑，將瓶浸于超聲波浴中受到超聲波輻射，以超聲波加 速分析物的溶解和擴散，提高萃取效率。

超聲波的頻率在16kHz?1GHz，人無法聽到。超聲波振動是分析物從樣 品中釋放出來的能量來源。萃取效率的提高源于聲壓的作用[31]。在超聲萃取 中，最重要的現象是：空化作用（大部分空泡的形成與崩解)，接觸面的摩擦 和擴散率的提高?？栈饔米顬殛P鍵，因為它對液體中發生的很多現象都有 直接的影響?？栈饔冒◤娚煺沽Χ碌男∨菪纬桑瑏碓从诰植客蝗坏膲?力差[31]。在持續的超聲強度下，小泡的形成與崩解形成動力學平衡。小泡的 形成與崩解過程活躍的作用于固液接觸面，從而提高的固體侵蝕過程[31]。

超聲萃取持續時間一般由幾分鐘到30分鐘不等，也有長達60-70分鐘的 [32_34]?；厥章逝c相同溫度下索式萃取法所得回收率相當。需要考慮的萃取條 件有超聲時間，萃取劑的極性和需要量，以及樣品的質量和種類。Melecchi 等[35]的研究表明萃取劑的極性和超聲時間對回收率的影響較大。超聲萃取的 優點是可以同時在超聲池中處理多個樣品。由于其在常溫下進行而適合熱不 穩定分析物的萃取。但是需要進一步去除雜質是本法的一個缺點。

3.3微波輔助萃取

微波輔助萃取（microwave-assisted extraction, MAE)始于 20 世紀 80 年

代，利用微波能量，快速有選擇地萃取，克服了傳統萃取方法的不足[3637]。 在密閉的容器中微波萃取，加熱萃取溶劑使其迅速達到2倍或3倍常壓時的

沸點溫度，從而縮短萃取時間，使溶劑消耗大為減少。攪拌促進與溶劑的作 用，有助于從基質中釋放目標物。極性分子如水、甲醇、乙醇、丙酮等可迅 速吸收微波能量來加熱；非極性物質不能吸收微波能量，所以MAE中不能 使用非極性溶劑做萃取劑。然而，MAE必須克服一些內在的缺點才可拓寬它 的應用范圍?；衔镂瘴⒉芰康亩嗌倥c其介電常數成比例，介電常數值 越高，能量吸收量越高。因為有機萃取典型地使用了具有很小介電常數的非 極性溶劑，因此常常必須用極性共溶劑以助溶液加熱[38]。用極性共溶劑除了 目標物外，還可萃取更廣譜的化合物，可引起分析中潛在的干擾。再者，微 波溶劑萃取并不排除傳統的過濾和蒸發步驟。

3.4超臨界流體萃取

20世紀80年代后期，隨著超臨界流體色譜的出現，超臨界流體萃取 (supercritical fluid extraction, SFE)應用于樣品制備。物質處于其臨界溫度

和臨界壓力以上的狀態時，既非氣體，也非液體，而是以超臨界流體狀態存 在。超臨界流體具有似氣體的高擴散性，能穿透固體物質；具有液體的溶解 特性，似液體的密度使其能將固體基質中的分析物溶解；它幾乎沒有表面張 力，低黏度使之便于流動。這些特性使超臨界流體具有極好的萃取效力和速 度。由于超臨界流體的密度既是溫度的函數，又是壓力的函數，因而，不論 改變溫度或壓力，都可使超臨界流體的密度發生變化。溶質的溶解度和超臨 界流體的密度有關，因而通過改變萃取壓力和萃取溫度就很容易改變超臨界 流體密度，從而實現對特定分析物的萃取。又由于超臨界流體的高蒸氣壓， 可以很容易從萃取物中除去，得到高度濃縮的萃取物[39]。

3.5加速溶劑萃取

1995 年首次發表了加速溶劑萃?。╝ccelerated solvent extraction, ASE)

技術，許多實驗室已用于常規樣品制備。ASE是一種在較高的溫度(50?200°C)

和10?15MPa的壓力下進行的固-液萃取過程。因此，ASE是一種類似于SFE 的加壓溶劑萃取。高壓使得溶劑在較高溫度下仍可以保持液態。在ASE過程 中，溶劑仍然低于臨界狀態。溫度的增加在萃取動力學上提高了萃取效率， 壓力的增加使溶劑保持在液態，因此可進行安全、快速的萃取。另外，高壓 使得萃取池快速被填充并且利于溶劑進入固體基質。升高的溫度提高了溶劑 的擴散率，從而導致萃取動力學上的萃取效率的提高[4()_42]。

在ASE萃取時，樣品置于不銹鋼萃取池中。加入溶劑后，萃取池加壓， 加熱到需要的溫度，樣品被靜置萃取指定的時間。然后，萃取液從萃取池中 排出，再加入新鮮溶劑。根據需要重復進行這個過程數次。當萃取完成后， 壓縮氮氣使得萃取池中的所有液體轉移到收集瓶中待檢。整個萃取時間為 5?15min，需要萃取劑的量為萃取池容量的150%左右。由于萃取液在進入收 集器前經過過濾，所以省去了后續單獨的過濾步驟。

盡管用于ASE的溶劑通常是有機溶劑，加壓的熱水或亞臨界狀態的水也 用于ASE，通常被稱為加壓熱水萃取或亞臨界水萃取[43]。

非毒性萃取劑，如水、二氧化碳的使用有經濟環保的優點。超臨界二氧 化碳萃取被報道為一種有價值的新萃取技術，可用于營養物質的萃取。但是， 需要加入大量的極化修飾因子到二氧化碳中來萃取極性物質。ASE被認為是 一種潛在的可替換SFE的極性化合物萃取技術[4()]。與傳統的索式萃取相比， 大量減少了萃取液量和萃取時間[42]。但是，值得注意的是ASE的高溫可能導 致熱不穩定化合物的降解。

3.6固相萃取

固相萃?。╯olid phase extraction, SPE)基于液相色譜的原理分離樣品組

分，即樣品通過固體吸附劑進行凈化，固體吸著劑捕獲樣品中的目標物，同 時將其富集。它是20世紀80年代后期發展起來的樣品前處理技術。自制的

做法是將吸著劑填入玻璃小柱或小注射器或滴管中，溶劑自然流出。商品化 以來，迅速發展成為痕量分析中樣品處理的常規手段。商品化的填充吸著劑 的小柱稱為柱體（cartridge)，其后又發展了萃取碟片（disk)?，F今市場上出 售的多種SPE的極性、非極性或離子交換吸著劑，原來分別是為液相色譜設 計的正相、反相和離子交換等固定相。常用固相萃取劑有以下幾類。吸附型: 硅膠、氧化鋁、硅鎂吸附劑、活性炭等；鍵合型：鍵合硅膠固相萃取劑種類 頗多，所鍵合的基團包括C8、C18等非極性基團，或弱極性基團如一NH2、 一CN、一OH等，及一COOH、一S03H等離子基團；非極性和離子交換網絡 樹脂和商聚物等。

固相微萃?。╯olid phase microextraction, SPME)是用一根外涂有吸著

劑的熔融石英纖維或內涂以吸著材料的小管進行萃取。由Arthur和 PawliSZyn[44]針對存在的問題，基于聚二甲基硅氧烷吸著而發展了微萃取 方法，命名為固相微萃取。由于其技術簡易和性能優異，弓丨起了人們對吸著 萃取技術的極大關注。SPE與SPME的主要區別是：SPE需要在液相中萃取 目標物；而SPME用一根外涂有吸著劑的熔融石英纖維或內涂以吸著材料的 小管進行萃取。SPME可在氣相和液相中萃取，而SPE只限于液相樣品的萃 取。食品分析已應用SPME技術[45’46]。

3.7膜萃取

膜萃?。╩embrane extraction)是一類應用于許多萃取問題的技術。這些 技術只需要很少的溶劑但能得到顯著的凈化效力。Audunsson首先將膜萃取 作為分析化學中樣品制備的工具[47]。液膜支撐萃?。╯upported liquid membrane extraction)是分析樣品最常用的膜萃取技術。在此三相萃取技術中， 從含水試樣中萃取目標物通過有機液體再進入水相。有機相保持在多孔、疏 水支撐膜間。由于毛細現象使孔中保持著有機液體。因此，存在兩個不同的

平衡使此體系在化學上相似于經典的液-液萃取中的萃取和反萃取。

3.8食品中丙烯酰胺的萃取方法

丙烯酰胺性質不穩定，紫外線照射或加熱至熔點時易發生聚合反應。有 文獻報道[48]，在實驗室條件下，0.1%的丙烯酰胺水溶液用玻璃器皿盛裝，在 室溫下4周就只剩原來的50%。在環境和土壤里丙烯酰胺還存在生物轉化， 其半減期僅幾天（20°C)。但是其在低溫、避光時可以長期保存。所分析的樣 品應該均勻，固體樣品要碾碎，顆粒越細，提取效率越高；可采用人工和機 械磨碎兩種方式，需要注意的是要充分混勻。

食品樣品基質比其他性質樣品（如水、土、氣等）復雜得多，因而食品 樣品前處理方法尤其具有特殊性。在食品品質、成分和污染物的檢測中，有 機污染物分析存在更多難題[49]。（1)根據目標物的毒性、致突變性、致癌性 的強弱，它們在食品中的允許限量為mg/kg、pg/kg、ng/kg或更低，因而要 求高靈敏度的測定方法，即在lkg樣品中要求能檢出l(T3g、l(T6g、10、或 更低含量的目標物。（2)食品樣品基質與目標物含量相差百萬倍、千萬倍甚 至億倍，在此情況下，由樣品中萃取目標物，應盡量減少共萃取物，選擇適 宜的溶劑是十分重要的。（3)在樣品萃取液中有干擾分析的共萃取物存在， 增加了分析的復雜性。樣品中目標物含量極微，同時共存的大量干擾物必須 除去。

丙烯酰胺是極性小分子物質，一般采用水或極性強的有機溶劑萃取。目 前報道的食品中丙烯酰胺的萃取方法大多采用常溫下的水作為萃取劑[5()_52]。 水萃取有冷水萃取和熱水萃取兩種方法。冷萃取是指在樣品磨碎后按一定比 例加入水，振蕩或攪拌30min;熱萃取是在研磨的樣品中直接加入60?70°C 的熱水，70°C振蕩30min。丙烯酰胺在酸性溶液中穩定，堿性條件下不穩定。 有人用酸性水溶液作為萃取劑，如美國FDA建議的方法就用含0.1%的甲酸

水溶液萃取樣品[53]。也有研究者為方便旋轉蒸發濃縮而采用甲醇作為萃取劑 [54-55]。Young等[56]為了阻止在樣品前處理過程中發生乳化作用而采用高濃度 的氯化鈉水溶液來萃取樣品，結果表明可以提高丙烯酰胺的回收率。也有實 驗室用水-丙酮混合物作為萃取劑[571另外，日本國立醫藥品食品衛生研究所 的一個研究小組也采用這種混合物作為萃取劑[58]。液體樣品可直接進行衍生 或凈化處理后衍生，而固體樣品則需要萃取后再進行凈化處理和衍生。對于 脂肪含量高的樣品，采用有機體系，可以萃取更完全，而且易于濃縮，便于 以后的凈化處理。Biedermaim等[59]分別采用正丙醇-水（4: 1)混合溶劑和 丁酮萃取。聚丙烯釀胺水凝膠中丙烯釀胺單體的提取及高效液相色譜測定,相對于水萃取法，該體系具有以下兩個優點：（1)同時萃取出包 埋在脂肪顆粒中的丙烯酰胺，提取更完全；（2)采用正丙醇-水體系時，正丙 醇和水形成共沸物，易于濃縮并去除水分；用丁酮萃取時，可用無水硫酸鈉 脫水，旋轉蒸發濃縮。

除了上述方法以外，ASE和索式萃取也已應用于丙烯酰胺的測定[6Q_62]。 Pedersen等[6()]采用甲醇進行索式萃取，據報道其萃取效率遠高于其他方法， 但長達10天的萃取時間不能排除萃取過程中有新的丙烯酰胺形成。

樣品的凈化主要采用固相萃取，大多為幾種固相萃取柱的連用。一種是 米用 Oasis HLB (Waters，Milford, MA，USA)和 Bond Elut-Accucat 柱 (mixedmode: Cs，SAX and SCX) (Varian，Palo Alto，CA，USA)。Becalski 等[52]用三種不同柱子連用：Oasis MAX ( mixed-mode anion exchange ) (Waters)、Oasis MCX ( mixed-mode canion exchange)和 ENVI-Carb (graphitized carbon)。另一種類似的組合是 Bond Elut C18, Bond Elut Jr-PSA (anion exchange)和 Bond Elut Accucat(all Variant58]。另一組實驗室用 Isolute M-M 300mg 柱子（mixed-mode: Ci8，SAX and SCX) (International Sorbent Technology, Hengoed，UK)加上過濾或超速離心來避免阻塞色譜系統。

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Oasis HLB柱子在丙烯酰胺分析的凈化步驟中應用最廣泛，因為對 所有化合物和一般的SPE要求有親水親脂平衡和可濕的反相吸收劑。很多研 究者[63_65]報道了丙烯酰胺色譜分析前這種柱子的應用。Oasis MCX柱子也在 SPE凈化步驟中應用，是一種混合模式的陽離子反相吸收劑，對基本化合物 有高度選擇性。在丙烯酰胺分析中合理有效的應用可獲得高精確性和高方法 回收率。Young等[56]把檢測丙烯酰胺的SPE方案分為兩步。第一步，用Oasis HLB柱子接真空復式接頭連接真空裝置使流速為2~4mL/min。第二步不用真 空因為用大顆粒的Oasis MCX柱子。在這種SPE凈化條件下，日內研究得到 很好的精確度和方法精確度，通過3天得到98%的回收率和相對標準差為 9.5% (n=15)〇

4高效液相色譜對丙烯酰胺的檢測 4.1高效液相色譜原理

色譜法的分離原理是：溶于流動相（mobile phase)中的各組分經過固定 相時，由于與固定相（stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸弓丨、 排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固 定相中流出。又稱為色層法、層析法。

色譜法最早是由俄國植物學家茨維特（Tswett)在1906年研究用碳酸鈣 分離植物色素時發現的，色譜法（Chromatography)因之得名。后來在此基 礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。

液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸 送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。 高效液相色譜法是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色 譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻， 小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液

相色譜法（High Pressure Liquid Chromatography, HPLC)。又因分析速度快 而稱為高速液相色譜法（High Speed Liquid Chromatography, HSLP)。也稱

現代液相色譜[66_67]。

HPLC有以下特點[67]:

高壓——壓力可達150?300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。 高速流速為0.1?10.0 mL/min。

高效一可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。

高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達O.Olng。同時消耗樣品少。

HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：

速度快通常分析一個樣品在15~30 min,有些樣品甚至在5 min內即

可完成。

分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。

靈敏度高——紫外檢測器可達〇.〇lng，熒光和電化學檢測器可達O.lpg。 柱子可反復使用一用一根色譜柱可分離不同的化合物。

樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組 分或做制備。

高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜 法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法[68]。

(1)液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是 根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附一解吸附的 平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5?10pm。適用于分離分子 量200?1000的組分，大多數用于非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。 常用于分離同分異構體。

(2)液液色譜法使用將特定的液態物質涂于擔體表面，或化學鍵合于

21

擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相 中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。

涂布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減 少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子 的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于 涂布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少采用?，F在多采用的是化學 鍵合固定相，如c18、c8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法和反相色譜 法。

正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動 相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異 丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性 和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

反相色譜法一般用非極性固定相（如c18、c8);流動相為水或緩沖液， 常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節 保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。反相色譜法在現代液相 色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。

隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用于 某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩 沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，（：18和C8使用的pH值通常為 2.5?7.5 (2?8)，太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫 落。有報告新商品柱可在pH 1.5?10范圍操作。

(3)離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交 聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換

樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂 上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交 換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。

緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保 留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動 相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與 固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導 致樣品較快流出。

離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

(4)離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根 據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固 定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸 堿物質。

分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺 酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。

分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。

離子對色譜法常用ODS柱（即C18)，流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中 加入3?10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組 分保留時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。

(5)排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶 解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的 化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同 的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提 取物、多狀、蛋白質、核酸等。

23

4.2高效液相色譜對丙烯酰胺的檢測

用于丙烯酰胺直接測定的液相方法普遍采用反相色譜，選用非極性的C18 柱或等效柱（同時使用保護柱）。Ono等[69]曾嘗試采用強極性的石墨化炭黑 柱，結果不理想：一方面干擾物質在MS-MS條件下產生與丙烯酰胺相同的 子離子；另一方面丙烯酰胺及干擾物的保留時間在同一型號的不同柱子上每 次都有較大的漂移。C18柱廣泛應用于各類物質的測定，可供選擇的色譜柱種 類繁多。不同廠家提供的C18柱性能、特點各有不同。在具體的應用中，不 同的研究人員采用不同的色譜柱，不同的流動相。如？0八[53]采用Aqua C18 (250mmx2mm)，流動相為水（0.1%乙酸，0.5%甲醇）；Rosen[51]米用 Hpercarb 50mmx2.1mm)，保護柱10mmx2.1mm)，流動相為甲醇-水 (20: 80); Tareke[5Q]米用 Hpercarb50mm><2.1mm)，流動相為水;

Ono 米用 Atlantis dCi8 (5[j_m，150mm><2.1mm)，保護柱為 OptiGuard mini (15mmxl.〇mm)，流動相為甲醇-水（10: 90)。

Ono 等選用的 Atlantis dCi8150mm><2.1mm)耐受有機溶劑，且

有機溶劑的使用延緩了丙烯酰胺的出峰時間，提高了樣品的揮發性，使得離 子化效率進一步提高。各種色譜柱分離效果的差異說明無論選擇那種色譜柱， 均應驗證后使用。

日本國家衛生研究所（National Institute of Health Sciences)將一種新型

色譜技術應用于丙烯酰胺的測定——柱切換技術與質譜聯用[58]。這種方法采

用四根色譜柱串聯的方式實現，四根色譜柱一次為：柱1Hpercarb (5pm，

50mm><2.1mm)，柱 2Shodex Mspak GF-310 4B50mmx4.6mm),

柱 3Atlantis dC18 ( 5[j_m , 150mm><2.1mm )，柱 4Develosil

RPAQUEOUS-AR-3 (3pm，35mmx2.0mm)。色譜條件為柱溫箱：柱 1?3 為 40°C，柱4為室溫;流動相：含0.1%乙酸的甲醇-水（5: 95);流速:0.25mL/min;

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柱切換：柱1—柱2為1.75?2.05min，柱2—柱3為4.66?5.15min，柱4(流 出）為 8.5min。

采用凝膠柱作為凈化手段，與分析柱RP-18 GP ((：18柱）串聯，再與質 譜聯用，實現在線凈化-分離，大大縮短了分析周期[™]。除了上述介紹的方法 以外，有實驗室[71]采用離子排阻色譜柱作為分析柱，紫外檢測器測定食品中 的丙烯酰胺。

綜上所述，聚丙烯酰胺及其水凝膠有著廣泛的應用，并且在很多行業中， 人們因為擔心其可能降解而產生對人或動物有害的物質，所以對其應用的各 個領域中可能的降解進行了廣泛的研究。對于臨床醫學中聚丙烯酰胺水凝膠 注射隆乳的應用，由于其植入體內后與人體組織永久接觸，因此對其在人體 中穩定性的問題就更加值得關注，而且鑒于聚丙烯酰胺水凝膠隆乳后產生諸 多并發癥，就不得不懷疑其在人體組織復雜的生物環境中是否能長期穩定存 在。聚丙烯酰胺在一定的條件下可以發生降解，其降解產生的丙烯酰胺單體 又對人體有明確的毒性，它是否與諸多并發癥有聯系呢？以往的研究沒有給 出明確的答案，其主要原因是樣品處理和檢測分析手段難以讓人信服。本課 題希望對聚丙烯酰胺水凝膠中丙烯酰胺單體的提取及HPLC檢測方法的研究 對丙烯酰胺單體進行檢測并準確定量，從而就上述疑問給出一個滿意的答案。

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正 文

實驗一聚丙烯酰胺水凝膠中丙烯酰胺單體的提取與凈化

聚丙烯酰胺水凝膠是由丙烯酰胺、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺作為交聯劑共 聚合而形成網狀分子，可與大量水結合，溶脹形成水凝膠狀物，但其不能溶 于水。如果按常規方法來提取丙烯酰胺，凝膠體將使提取過程難以進行，如 食品行業中丙烯酰胺的提取方法，很難使丙烯酰胺單體完全提取出；另外， 從人體中取出的聚丙烯酰胺水凝膠由于與體液進行交換而含有多種復雜化學 成分，影響丙烯酰胺的純化。本實驗比較了幾種常見提取方法的回收率，以 找到最佳的丙烯酰胺提取方法。

1試劑與儀器 1.1試劑

丙烯酰胺（99.5%，優級純，陜西中美生物科技有限公司）；

甲醇（色譜級，Fisher Scientific公司，美國）；

二次蒸餾水；

醫用聚丙烯酰胺水凝膠（奧美定，吉林富華醫用高分子材料有限公司）。 1.2儀器設備

BR4i高速臺式離心機（Thermo Electro公司，美國）；

MTN-2800D氮吹濃縮儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；

梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司AL204電子天平；

大旋轉過濾管，0.45 umPVDF (Alltech公司，美國)；

Oasis HLB6cc(200mg)固相萃取柱（Waters 公司，美國)；

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Bond Elut-Accucat (mixed mode, Cs, SAX and SCX) 3mL 固相萃取柱 (Varian公司，美國）；

SKY-100B恒溫培養搖床（上海蘇坤實業有限公司）；

KQ-100DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；

Milli-Q超純水裝置（美國Millipore);

ASE200快速溶劑萃取儀，配有llmL不銹鋼萃取池，60mL收集瓶（美 國戴安公司）。

1.3溶液配置

丙烯酰胺標準溶液的配置：準確稱取適量的丙烯酰胺標準品（精確至 O.lmg)，聚丙烯釀胺水凝膠中丙烯釀胺單體的提取及高效液相色譜測定,用水溶解，配制成質量濃度為l.〇xl〇_4g/mL的標準儲備液，根據需 要用水稀釋成適宜濃度的標準工作溶液。所有配置溶液在用于高效液相色譜 前均經過0.45pm的微孔濾膜過濾。

2實驗方法

2.1超聲輔助甲醇萃取法 2.1.1萃取方法

(1)準確稱取lg聚丙烯酰胺水凝膠；

(2)少量多次加入甲醇9mL，邊加入邊攪拌，直至凝膠體由透明膠狀轉變 為白色顆粒狀；

(3)將上面得到的混合液密封，置于超聲清洗器中30min;

(4)于離心機中9000轉/min離心15min;

(5)小心倒取上清液于帶有0.45pm膜的大旋轉過濾管中，9000轉/min過濾 離心5min;

(6)取出過濾液，置于氮吹儀下，常溫吹干；

27

(7)加水至2mL，準備下一步凈化處理。

2.1.2凈化方法

(1)按順序加入3.5mL甲醇、3.5mL蒸餾水，準備OASIS固相萃取柱，將

濾過液丟棄；

(2)加入2.1.1最終得到的1.5mL提取液于OASIS固相萃取柱，使之完全通 過，丟棄濾過液；

(3)用0.5mL蒸權水洗柱并丟棄；

(4)再用1.5mL蒸館水洗柱并收集洗脫液，為過Varian固相萃取柱做準備， 注意上述每一步都不要用負壓或正壓方式加速洗脫過程；

(5)在Varian固相萃取柱吸附床上lmL處做標記；

(6)按順序加入2.5ml甲醇、2.5ml蒸館水，準備Varian固相萃取柱，并丟

棄過濾液；

(7)將步驟（4)中得到的1.5mL提取液加入到Varian固相萃取柱中，當液 面降至lmL標記處時開始收集洗脫液，最終得到lmL洗脫液，待HPLC檢 測或濃縮后檢測。

2.2 ASE 法 2.2.1萃取方法

(1)準確稱取lg聚丙烯酰胺水凝膠；

(2)加入10g勻質沙?；旌蠑嚢柚辆鶆?；

(3)將樣品沙?；旌衔镛D移到不銹鋼萃取池；

(4)將萃取池放入ASE快速溶劑萃取儀中進行萃??；

(5)ASE萃取儀條件：

系統壓力：lOMpa (1500psi)

溫度：80°C

28

加熱時間：5min 靜態時間：5min

溶劑：甲醇 沖洗體積：10%

氮氣吹掃：IMpa (150psi)，60 秒

(6)最后收集得到2mL萃取液，待進一步凈化。

2.2.2凈化方法 同 2.1.2。

2.3水浸泡萃取法 2.3.1萃取方法

(1)準確稱取O.lg聚丙烯酰胺水凝膠；

(2) 加蒸餾水至10mL，37°C恒溫振蕩72小時；

(3)9000轉/min離心30分鐘;

(4)取上清液2mL。

2.3.2凈化方法

同 2.1.2。

2.3.3后續處理

(1)置于氮吹儀下完全吹干；

(2)加入50^L蒸餾水待測。

2.4 HPLC檢測條件

色譜柱為 AngilentTC-Ci8柱（5(j_m，150mmx4.6mm)，流動相為 100%水; 流速lmL/min;紫外線檢測波長210nm;進樣量20pL;柱溫為室溫。

2.5回收率測定方法

(1)取未植入人體的聚丙烯酰胺樣品3份，每份均經上述3種樣品前處理方

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法處理后，進行HPLC檢測，重復進行3次，計算平均值、標準差；

(2)按3份樣品檢測的濃度由低到高分別添加0.2、1、5)ig/mL三種不同濃 度丙烯酰胺標準溶液后，密閉避光放置24h，使凝膠與丙烯酰胺標準溶液充 分混合；

(3)按同樣的3中樣品前處理方法分別處理加標樣品，再行HPLC測定，每 個樣品測定3次，計算平均值與標準差；

(4)最后計算加標回收率。

3結果與討論

3.1 3種樣品前處理方法回收率比較

加標回收率結果如表1-1?3所示：

表1-1超聲輔助甲醇萃取法丙烯酰胺回收率

序號-AM 含量（jig/mL)回收率（％)

加標前加標量加標后

10.123 士 0.0110.20.211 士 0.01344.2 士 6.5

20.295士 0.0161.00.865士 0.03057.0 士 3.0

30.546士 0.0235.04.047士 0.08870.0 士 1.8

表1-2水浸泡萃取法丙烯酰胺回收率

序號-AM 含量（jig/mL)回收率（％)

加標前加標量加標后

10.248士 0.0140.20.424士 0.01787.8 士 8.3

20.467士 0.0191.01.382士 0.03491.5 士 3.5

30.727士 0.0265.05.473士 0.11394.9 士 2.3

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表1-3 ASE法丙烯酰胺回收率

AM 含量（(ig/mL)

序號

加標前

加標量

加標后

回收率（％)

10.102 士 0.0090.20.174 士 0.01136.2 士 5.7

20.252士 0.0131.00.739士 0.02748.7 士 2.7

30.513 士 0.0215.03.725士 0.07064.2 士 1.4

3種方法的回收率比較如圖1-1所示:

m

o

4D; ■

w

M—

嘴

2D.

n

Me^n +-1

處

0,2

1,0

5-.0

u.............||............

圖1-13種樣品前處理方法回收率比較圖

水浸泡萃取法的回收率明顯高于其他兩種方法。根據聚丙烯酰胺水凝膠 的特性及丙烯酰胺在水中溶解度最大，過量的水使聚丙烯酰胺水凝膠達到完 全的溶脹狀態，丙烯酰胺單體則在水凝膠內、外水中達到平衡，這樣就可以

31

通過測定提取液中丙烯酰胺的含量間接得出聚丙烯酰胺水凝膠中丙烯酰胺單 體的準確含量，通過對檢測基質的替換，不但極大地簡化了樣品處理過程， 而且加標回收率實驗也獲得了滿意結果。

3.2凈化方法的選擇

在從樣品中提取丙烯酰胺單體的過程中，特別是從人體取出的樣品，不 可避免地會將人體體液內的某些有機和無機成分一起提取出來。這些內源性 雜質如果不經過凈化處理，在進入HPLC檢測時，可能會堵塞色譜柱，影響 其使用壽命，而且可導致色譜圖干擾峰較多，基線不穩定，影響檢測結果， 所以必須通過凈化處理來去除這些雜質。

傳統的凈化手段是反復的液一液萃取，手續復雜、耗時、有機溶劑消耗 量大，且被測物在液一液萃取過程中損失較大，不利于微量物質的檢測。固 相萃取方法（SPE)具有消耗溶劑量少、對樣品污染少、處理時間短、被測 物的損失小等特點，目前已成為純化樣品中待檢成分的有效方法。

本實驗所選用的Oasis HLB 6mL ( 200mg )固相萃取柱和Bond Elut-Accucat (mixed mode, Cs, SAX and SCX) 3mL (200mg)固相萃取柱， 是美國FDA公布的食品中檢測丙烯酰胺標準方法中所采用的固相萃取柱。通 過實驗證明聯合應用兩種固相萃取柱，可以快速、有效地去除提取液中的雜 質，色譜峰形好，基線平穩，雜質峰干擾少，定量準確。對應用與未應用兩 種固相萃取柱的比較見圖1-2?3。

32

 

20 -

圖1-3應用兩種固相萃取柱的樣品色譜圖

33

閣1-2米K、/:川|構種N相草収樸:的樣品色記浪

有文獻報道，在食品中檢測丙烯酰胺，單純使用Oasis HLB 固相萃取柱也可以獲得滿意的效果。本實驗也曾嘗試應用，但在 色譜圖上出現較多的雜質峰干擾，造成定量困難，這可能與測試 基質不同，因而雜質成分不同有關。聯用兩種固相萃取柱對提取 液進行凈化，分離雜質完全、徹底，純化被測物效果好。雖然增 加一個柱子增加了丙烯酰胺的損失，但避免了色譜圖的雜質峰干 擾，不失為一種較好的選擇。

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實驗二聚丙烯酰胺水凝膠中丙烯酰胺的HPLC檢測

過去有學者曾采用HPLC的方法對聚丙烯酰胺中的丙烯酰胺進行檢測 [22-72_M，但樣品前處理方法不統一，且提供的方法不很明確，結果的說服力 不足。本實驗采用實驗一中水浸泡萃取法進行樣品前處理，對丙烯酰胺的 HPLC檢測方法進行全面的研究，建立了準確、有效的丙烯酰胺HPLC檢測 方法，可以客觀的對聚丙烯酰胺中的丙烯酰胺含量進行分析。

1伩器與設備

HP1100型高效液相色譜儀，配有紫外檢測器、二元梯度泵、20pL定量 環；

色譜柱：150mm><4.6mm，粒度 5|am，填料：AngilentTC-Ci8;

BR4i高速臺式離心機（Thermo Electro公司，美國）；

MTN-2800D氮吹濃縮儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；

梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司AL204電子天平；

大旋轉過濾管，0.45 pmPVDF (Alltech公司，美國)；

Oasis HLB 6cc (200mg)固相萃耳又柱（Waters公司，美國)；

Bond Elut-Accucat (mixed mode, C& SAX and SCX) 3mL 固相萃耳又柱 (Varian公司，美國）；

SKY-100B恒溫培養搖床（上海蘇坤實業有限公司）；

Milli-Q超純水裝置（美國Millipore);

丙烯酰胺（99.5%，優級純，陜西中美生物科技有限公司）；

甲醇（色譜級，Fisher Scientific公司，美國）;

35

二次蒸餾水；

醫用聚丙烯酰胺水凝膠（奧美定，吉林富華醫用高分子材料有限公司）； 從患者體內抽出的聚丙烯酰胺水凝膠。

所有配置溶液在用于高效液相色譜前均經過0.45pm的微孔濾膜過濾。

2實驗方法 2.1樣品處理方法 2.1.1提取方法

(1)準確稱取lg聚丙烯酰胺水凝膠或從人體中取出的聚丙烯酰胺水凝膠， 加蒸餾水至10mL，37°C恒溫振蕩24小時；

(2)于離心機中9000轉/min離心30分鐘;

(3)取上清液2mL，待下一步凈化。

2.1.2凈化方法

(1)按順序加入3.5mL甲醇、3.5mL蒸餾水，準備OASIS固相萃取柱，將

濾過液丟棄；

(2)加入2.1.1最終得到的1.5mL提取液于OASIS固相萃取柱，使之完全通 過，丟棄濾過液；

(3)用0.5mL蒸權水洗柱并丟棄；

(4)再用1.5mL蒸館水洗柱并收集洗脫液，為過Varian固相萃取柱做準備， 注意上述每一步都不要用負壓或正壓方式加速洗脫過程；

(5)在Varian固相萃取柱吸附床上lmL處做標記；

(6)按順序加入2.5mL甲醇、2.5mL蒸館水，準備Varian固相萃取柱，并

丟棄過濾液；

(7)將步驟（4)中得到的1.5mL提取液加入到Varian固相萃取柱中，當液

面降至lmL標記處時開始收集洗脫液，最終得到lmL洗脫液，待HPLC檢 測或濃縮后檢測。

2.2 HPLC分析條件

色譜柱為 AngilentTC-Ci8柱（5(j_m，150mmx4.6mm)，聚丙烯釀胺水凝膠中丙烯釀胺單體的提取及高效液相色譜測定,流動相為 100%水； 流速lmL/min;紫外線檢測波長210nm;進樣量20pL;柱溫為室溫。

3結果與討論

3.1樣品處理方法的選擇

樣品處理方法采用實驗一中的水浸泡萃取法。

浸泡時間的選擇。選定以水作為萃取溶劑后，又對不同浸泡時間的提取 效率再次進行比較，檢驗浸泡時間對提取效率是否有影響，并以此為基礎選 出最佳的浸泡時間。取有代表性的聚丙烯酰胺水凝膠樣品，按浸泡時間1、3、 5天分為三組，每組6份平行樣品，其中3份樣品加入等量的丙烯酰胺標準 溶液用以測定加標回收率，所有樣品密封后放入恒溫培養搖床，室溫，避光， 60轉/min,分別于1、3、5天后取一組樣品，離心后取上清液，0.45—的 PVDF膜離心過濾，過Oasis HLB及Bond Elut-Accucat固相萃取柱凈化，最 終的洗脫液入HPLC檢測。不同浸泡時間的加標回收率結果見表2-1。

表2-1不同浸泡時間回收率對比

浸泡時間（天）回收率（％)

188.3 土 5.5

393.5 土 2.4

593.7 土 2.1

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回收率結果顯示*浸泡時間為1天時，其回收率與3天和5天相比有明 顯差鹿，且標準差較大，測定值不穩定，說明浸泡1天還無法使丙烯酰胺達 到穩定的平衡分布。而3天和5天的'回收率結果沒有明顯差距，且測定值穩 定，結合實驗周期的考慮，浸泡3天無疑是更簡單、高效的方法，匪此本實 驗選擇3天為最佳的樣品浸泡時間。

3.2方法確證 3.2.1線性關系

分別適暈吸取己配制的丙烯酰胺（lmg/mL)，用水逐級稀釋，配制成標 樣濃度為0.05、0.5、1.0、10、50、100|ig/mL，在所選擇的色譜條件下進樣， 以標樣濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。其標準曲線、回 歸方程、相關系數如圖2-1所示。

(s*nvs)^Hs

 

020406080100120

 

丙烯酰胺濃度（M*g/ml)

圖2-1丙烯酰胺的標準曲線及相關系數

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結果表明，當丙烯酰胺含量為0.05-100|ig/mL時，丙烯酰胺峰面積（y) 和丙烯酰胺標準溶液濃度（|ig/mL)呈良好的線性關系，線性方程為：y = 122.59x- 18.398，相關系數 R2= 0.9997。

3.2.2最小檢出限（LOD)和最小定量限（LOQ)

取低濃度丙烯酰胺標準溶液，用水逐級稀釋并進樣測定，以信號噪聲比 (S/N)等于3為基準，測得該條件下丙烯酰胺的最小檢測限為0.05)ig/mL; 以信號噪聲比等于10為基準，測得丙烯酰胺的最小定量限為O.lSug/mL。最 小定量限〇.15|ig/mL與0.5|ig/mL色譜圖分別見圖2-2、3。

 

圖2-2最小定量限0.15|ig/mL色譜圖

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圖2-30.5|ig/mL丙烯酰胺標準溶液色譜圖

3.2.3精密度及穩定性實驗

取0.2、1、5)ig/mL的丙烯酰胺標準溶液分別代表低、中、高濃度，各濃 度溶液分別連續進樣6次，計算得到三個濃度測定數值的相對標準偏差 (RSD)分別為4.7%、3.3%和2.4%。取聚丙烯酰胺水凝膠樣品一份，按優 化后的方法進行樣品預處理，于1天內的6個不同時段進行HPLC分析；同 時，分8天連續測定，取平均值并計算RSD值。其日內和日間RSD值分別 為5.6%和6.7%，具體檢測數據見表2-2?4。

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表2-2三個濃度梯度丙烯酰胺標準溶液的檢測數據及RSD值

表2-3樣品日內測定數值及RSD值

樣品丙烯酰胺單體含量（Hg/mL)平均值RSD

12 3 4 56(jig/mL)(%)

聚丙烯酰 胺水凝膠0.4280.416 0.380 0.402 0.3680.3910.3985.6

表2-4樣品日間測定數值及RSD值

樣品_丙烯酰胺單體含量（Hg/mL)平均值RSD

12 3 4 5 670 (ng/mL) 〇丨（％)

聚丙烯酰 胺水凝膠0.3510.374 0.326 0.389 0.385 0.3420.3670.332 0.3586.7

丙烯酰胺濃測定濃度（|ig/mL)平均值

(ng/mL)RSD

(%)

度(jig/mL)123456

0.20.2120.1980.1890.2060.2090.1920.2014.7

1.00.9771.0450.0280.9940.9570.9890.9983.3

5.05.1045.0364.8875.0825.1394.8525.0172.4

3.2.4回收率實驗

對3瓶醫用PAMG產品，各取3份按實驗一中水浸泡萃取法進行樣品處 理并行HPLC檢測；再各取3份按上步檢測得到的濃度由低到高，分別添加 AM標準溶液0.2、1.0、5.0|ig/mL，用同樣方法進行處理、HPLC測定，得平

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均回收率>87%，如表2-5。

表2-5丙烯酰胺回收率

AM 含量（(ig/mL)

加標前加標量加標后

序號

回收率（％)

10.248士 0.0140.20.424士 0.01787.8 士 8.3

20.467士 0.0191.01.382士 0.03491.5 士 3.5

30.727士 0.0265.05.473士 0.11394.9 士 2.3

3.5實際樣品檢測

對未植入人體聚丙烯酰胺水凝膠5份樣品進行檢測，每份樣品重復測定 3次，檢測結果為0.2?0.8ng/mL，如表2-6所示；對從人體中取出聚丙烯酰 胺水凝膠5份樣品進行檢測，均低于最小檢出限。標準曲線及部分樣品檢測 色譜圖見圖2-4?6。

表2-6水凝膠樣品檢測數據

樣品編號丙烯酰胺含量（Hg/mL)

IIIIII平均值（|ig/mL)

10.3390.3080.3210.323

20.6870.7260.6590.691

30.2630.2940.2850.281

40.3430.3610.3270.344

50.5010.4520.4680.474

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圖2-4聚丙烯酰胺水凝膠樣品1 HPLC色譜圖

 

圖2-5聚丙烯酰胺水凝膠樣品3 HPLC色譜圖

43

 

 

tw

 

 

圖2-6聚丙烯酰胺水凝膠樣品4 HPLC色譜圖

44

 

小 結

本課題通過對超聲輔助甲醇萃取法、水浸泡萃取法和ASE法三種樣品 前處理方法，聚丙烯釀胺水凝膠中丙烯釀胺單體的提取及高效液相色譜測定,得出水浸泡萃取法是一種簡單、有效的提取聚丙烯酰胺水凝膠 中丙烯酰胺的方法。高效液相色譜檢測對丙烯酰胺的定性準確，提取效率高， 結果可靠。較其他方法步驟少、操作簡單、回收率高，適用于聚丙烯酰胺水 凝膠中丙烯酰胺單體含量的檢測。對植入與未植入人體的聚丙烯酰胺水凝膠 進行檢測，結果提示，植入人體的聚丙烯酰胺水凝膠在人體內未大量降解及 局部蓄積，且丙烯酰胺含量低于植入前水平，可能因為聚丙烯酰胺水凝膠中 的水份在人體組織復雜的生物環境中與體液進行交換，丙烯酰胺自由擴散， 被組織吸收、代謝使之含量減少。對于臨床出現的多種并發癥，可能不是殘 留單體單獨作用的原因，可能與其他因素有關。因此，對于其可能含有的其 他化學成分，以及水凝膠大分子結構的微觀變化及其長期的變化仍需進一步 探討。由于對從人體中抽出的聚丙烯酰胺水凝膠的檢測結果均低于最小檢出 限，所以有待于對丙烯酰胺更低濃度的檢測方法的建立。

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