聚丙烯酰胺(PAM)是一種線型水溶性高分子 聚合物，是丙烯酰胺均聚物和共聚物統稱，可溶 于水，具絮凝性、增稠性、耐剪切性、降阻性、 分散性等性能rn。被廣泛應用在石油開采、水處 理、紡織、造紙、選礦、醫藥、農業等領域[2-3]。 但是，PAM在為油田生產提高米收率問時，對地 面工程產生惡劣影響[3]。

注人地層的PAM隨原油/水混合液進人地面油 水分離與水處理終端，聚丙烯酰胺降解菌的分離鑒定及其降解特性,大幅度提高混合液粘度和 乳化性，使油水分離難度加大，造成采出水含油 量嚴重超標。部分含較高濃度PAM采出水外排， 使PAM進人地下油層，很難避免其滲透到地下水 層。PAM在地面水體和地下水中長期滯留，不僅 會改變水的理化性質，PAM本身會產生一部分化 學需氧量COD，也會對當地水環境造成嚴重污染[4]， 釋放傷害人和動物周圍神經系統丙烯酰胺'因 此，尋找一種高效降解PAM的方法是PAM使用者 和環境保護者的研究課題。

近年來，隨著微生物技術發展，微生物修復 技術成為降解PAM使其無害化重要手段[6]。PAM生 物降解菌篩選成為本領域研究熱點[7-8]。黃峰等從 中原油田取樣的污水中培養出的硫酸鹽還原菌， 可在聚合物驅油中生長繁殖并使PAM發生降解， 1 000 mgf的PAM溶液的粘度損失達19.6%『'夏 彥淵等從油田污水中分離出7株對聚丙烯酰胺的降 解有顯著效果的細菌，在以原油為基礎培養基碳 源，以NH4H2PO4為基礎培養基氮源，在最佳條件下 7株混合菌對聚丙烯酰胺粘度降解率可達32.6%[|0]。 張英筠等在被聚丙烯酰胺污染的水樣和土壤篩選 出生長良好菌種3株，優勢菌在高濃度的PAM溶 液中最適合的生長濃度為1 000~10 000 mg-L-1，并 對10 000 mg • L-1的PAM溶液有良好降解效果，此 菌種還可以對丙烯酰胺高效降解，使降解過程不 會對環境造成二次污染[11]。包木太等從勝利油田采 出水中篩選出1株PAM降解細菌，在溫度為 35丈、pH為7.5的條件下，500mg-L-1PAM溶液降 解率最高可達到38.4%，降解后不會對環境產生二 次污染[8]。

本試驗從聚丙烯酰胺生產廠區土壤中分離鑒 定出1株降解聚丙烯酰胺的細菌。研究該菌株的降 解能力及其適應條件，旨為聚丙烯酰胺生物修復 提供菌株資源和科學依據。

1材料與方法

1.1材料

菌源樣：大慶煉化聚合物二廠廠區土樣。

基礎培養液：蔗糖30g，K2HPO4.3H2O1.6g， KH2PO4-3H2〇 0.4 g，MgS〇4-7H2〇 0.06 g，NaCl 0.5 g, Fe(S〇4)3 0.03 g, CaCL 0.01 g, CuS〇4 0.05 mg, ZnS〇4 0.05 mg,蒸饋水 1 000 mL。

富集培養基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5 g,蒸饋水 1 000 mL。

1.2方法

1.2.1聚丙烯酰胺優勢降解菌的篩選與分離

采用平板脅迫馴化法篩選出聚丙烯酰胺優勢降 解菌[12]，并采用平板法分離純化菌株，保存備用。 1.2.2聚丙烯酰胺優勢降解菌的鑒定 1.2.2.1聚丙烯酰胺優勢降解菌的形態及生理生化特征

本試驗參照文獻[13-14]中菌株的常規鑒定方 法，對聚丙烯酰胺優勢降解菌進行鑒定：①觀察 菌株在牛肉膏固體培養基上的培養特征；②進行 革蘭氏染色；③在顯微鏡及掃描電鏡下觀察菌株 的形態特征[14];④進行葡萄糖發酵、氧化酶、過 氧化氫酶、甲基紅、淀粉水解、產氨、硝酸鹽還 原、產吲哚、硫化氫、明膠液化、V-P試驗等生理 生化試驗。

1.2.2.2聚丙烯酰胺優勢降解菌16S rRNA序列測定

降解菌16S rRNA序列測定由上海生工生物工 程技術服務有限公司完成。采用16S rRNA序列測 定法對菌株DNA進行提取、擴增及序列測定。所得 測序結果通過BLAST程序與GenBank中核酸數據進 行序列搜索比對后，選擇親緣關系較近的菌株作為 參比菌株，用MEGA4.0軟件構建系統發育樹。

結合菌株形態分析、生理生化特征和16S rRNA序列測定及系統發育分析，初步鑒定菌株的 歸屬。

1.2.2.3菌懸液的制備和OD值的測定

根據參考文獻[15]制備菌懸液，OD™為 1.000, 4丈下保存備用。

1.2.2.4聚丙烯酰胺濃度的測定

采用淀粉-碘化鎘分光光度法測定聚丙烯酰胺 濃度[17]。

1.2.2.5優勢降解菌的降解特性

采用單因素試驗法，設定不同的初始聚丙烯

88

90

IOQ

酰胺濃度、pH、溫度，來研究其對降解率與底物 pH的影響，以確定降解菌降解的最佳培養條件。

2結果與分析

2.1聚丙烯酰胺優勢降解菌的篩選與鑒定

通過PAM為唯一氮源的平板脅迫培養法篩選 分離出1株耐受PAM能力強、降解率高的細菌， 命名為PAMB3。

2.1.1PAMB3的培養特征和形態特征

通過牛肉膏固體培養基培養3 d觀察，PAMB3 單菌落為圓點狀，聚丙烯酰胺降解菌的分離鑒定及其降解特性,表面凸起略有褶皺，白色，不 透明，營養瓊脂上有可溶性色素(見圖1)。

該菌掃描電鏡放大5 000倍顯示為短桿菌、產 芽孢、無鞭毛，菌體大小為（0.38~0.45)mmx (1.73~1.97) mm。

 

圖1 PAMB3的掃描電鏡圖片(X5000) Fig. 1 SEM Image of PAMB3(x5000)

2.1.2PAMB3的生理生化特征

革蘭氏染色及生理生化實驗表明，降解菌 PAMB3為革蘭氏陽性菌，葡萄糖產酸、吲哚試 驗、硫化氫試驗、VP試驗、明膠液化、氧化酶試 驗、淀粉水解、硝酸鹽還原試驗、甲基紅試驗均 為陽性，葡萄糖產氣、過氧化氫酶試驗、產氨試 驗均為陰性。

2.1.3PAMB3 的 16S rRNA 序列分析

PAMB3的16S rRNA序列測定結果顯示，其 DNA測序長度為1 455 bp。測序結果在通過BLAST 程序與GenBank中核酸數據進行序列搜索比對，選 擇親緣關系較近的8菌株作為參比菌株，其16 S rRNA序列與枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)相似 度達到99.9%,用MEGA4.0軟件構建系統發育樹 (見圖2),其在Genbank上的登錄號為KF051998。

PAMB3(KF051998)

Bacillus subtilis partial (HE681728.1)

Bacillus subtilis strain (JQ435698.1)

Bacillus megaterium strain (Q96576 8.1)

6^ ^1 Bacillus safensis strain (JQ951230.1)

1〇C Bacillus pumilus strain (JQ965500.1)

Bacillus cereus strain (JQ951231.1)

Bacillus licheniformis strain (JQ846014.1) Bacillus macauensis (AKKV01000016.1)

圖2 PAMB3的系統發育樹 Fig. 2 Phylogenetic tree of PAMB3

2.2降解菌PAMB3的降解特性

2.2.1降解菌PAMB3對PAM的降解曲線

無菌條件下，將2 %的菌懸液加人含500 mg.L-1 聚丙烯酰胺的基礎培養液中，3次重復，置于空氣 浴搖床(30丈，120 r.min1)進行培養，每天取樣測 定培養基pH和聚丙烯酰胺的降解率變化情況，結 果見圖3。

由圖3可以看出，在培養的過程中培養基pH 值與聚丙烯酰胺的降解率變化規律恰好相反，培 養基pH值逐漸降低而降解率逐漸升高，這是由于 淀粉碘化鎘法測定的是酰胺鍵的含量，降解率大 小表征其降解程度，另降解菌將聚丙烯酰胺中的 酰胺鍵水解成羧基，導致培養液pH下降，聚丙烯酰胺降解菌的分離鑒定及其降解特性,故pH 的變化也可表征酰胺鍵的降解程度，故表現出相 反規律。培養7 d后細菌生長進人穩定期，菌體的 pH值和降解率均變化不大，聚丙烯酰胺的降解率 在 34%。

2.2.2底物濃度對PAM降解的影響

無菌條件下，在含不同初始聚丙烯酰胺濃度

o o o o C

5 4 3 2 1

uo-sKPRIrpQ

(％)#*鏗

的基礎培養液中，接人2%(V/V)菌懸液，設3次重 復，置于空氣浴搖床(30丈，120 r.min-1)培養7 d, 取樣測培養基pH,計算聚丙烯酰胺降解率和降解 量，其結果見圖4、5。

 

圖4 PAM初始濃度對降解的影響 Fig. 4 Effect of the initial concentration of polyacrylamide on degradation

2.2.3溫度對PAM降解的影響

 

圖5 PAM初始濃度對PAM降解量的影響 Fig. 5 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on degradation amount

—降解率 Degradation rate -OD

0 5 0 2 11

UOIl!?PRIrp>Q

(％)#槳鏗

0 5 0 5 0 5

5 4 4 3 3 2

 

OD值

OD value

-0 5 0 5 0 -21100

45678910 11 1：

pH

圖7初始pH對PAMB3降解的影響 Fig.7 Effect of pH on polyacrylamide degradation

由圖4、圖5可以看出，在底物濃度為50~1 500 mg.L-1變化時，聚丙烯酰胺降解菌的分離鑒定及其降解特性,聚丙烯酰胺降解率和降解量均 隨初始聚丙烯酰胺濃度的增加而先升高后降低， 而pH變化恰好相反。pH值極小值及降解率極大值 出現在初始濃度300~500 mg.L-1處，而降解量最大 值出現在初始濃度500 mg.L-1處。當初始聚丙烯酰 胺濃度較低時，培養液內氮源不足，限制菌體的 生長。當初始聚丙烯酰胺濃度過高時會抑制菌體 的生長和降解。綜合考慮確定500 mg.L-1聚丙烯酰 胺為較佳初始濃度。

由圖6可知，從15丈開始，隨溫度增加PAM降 解率迅速上升，在30丈時降解率達最大值；超過 30丈時，降解率則隨溫度的升高而下降。而pH變 化恰好相反。PAMB3的適宜溫度為25~40丈。

2.2.4pH對降解PAM的影響

無菌條件下，用1 mo卜L-1的鹽酸和1 mol.L-1的 氫氧化鈉調整基礎培養液的初始pH值，滅菌后加 人聚丙烯酰胺，使其濃度為500 mg.L-1，再按照 2%比例接人菌懸液，3次重復，置于空氣浴搖床 (30丈，120 r.min-1)進行培養，7 d取樣測菌體生 長量和聚丙烯酰胺降解率。

無菌條件下，按2 %接菌量將菌懸液加人到含 聚丙烯酰胺濃度為500 mg.L-1的基礎培養液中，設 3次重復，置一定溫度空氣浴搖床（120 r.min1) 培養7 d取樣，測培養液pH和聚丙烯酰胺降解率， 結果見圖6。

▲降解率 Degradation rate n 7-2 -^pH/

 

15202530354045

溫度(TO

Temperature

圖6培養溫度對PAMB3降解的影響 Fig. 6 Effect of temperature on PAMB3 polyacrylamide degradation

6.2

由圖7可以看出，在pH 6~11能保持較高的降 解能力。3.0~9.0，菌株的生長量和聚丙烯酰胺的 降解率隨著pH值的升高而迅速增大；pH在9.0時 菌株的生長量和聚丙烯酰胺的降解率均達最大值， 為45.04%。9.0~12.0，菌體生長量和降解率均隨 pH的升高而減小。pH矣4和pH&12時菌種基本不 生長，該菌株較適合在偏堿性條件下生活。

3討論與結論

本試驗分離降解菌PAMB3在聚丙烯酰胺初始濃 度為500 mg.L-1，聚丙烯酰胺降解菌的分離鑒定及其降解特性,溫度為30丈，pH 9.0時，降解率較 高為45.04%，由于其最適pH為偏堿性，當培養基 pH 8~10時，降解率均在40 %以上，因此此菌株較 適合應用在3次采油廢水處理中。由于芽孢桿菌繁 殖快速、生命力強、體積大，能有效抑制有害菌生 長繁殖，在工農業和醫學上都有廣泛應用。目前研 究多將芽孢桿菌作為飼料添加劑、微生物肥料及酶 制劑等。本試驗分離的枯草芽孢桿菌PAMB3可應 用到處理采油廢水中降解聚丙烯酰胺，無二次污 染，對聚丙烯酰胺生物修復具有重要意義。

本試驗采用平板脅迫馴化方法，篩選出一株可 利用聚丙烯酰胺為唯一氮源生長的細菌PAMB3, 通過形態分析、生理生化實驗及16SrRNA序列分 析，初步鑒定PAMB3為枯草芽孢桿菌(Bac瓜似 設^)。本研究表明，PAMB3對聚丙烯酰胺的降解 能力與溫度、pH及底物濃度相關。PAMB3降解聚 丙烯酰胺的適宜條件初始濃度為200~700 mg.L-1， 溫度為25~40丈，pH為6~11。