凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠（PAGE)電泳技術。 Southern雜交由于步驟繁瑣、耗時長和同位素放射性 污染等缺點，在_般實驗中使用較少;瓊脂糖凝膠電泳 技術以其操作簡單、耗時短而被廣泛使用，但瓊脂糖凝 膠電泳卻無法分辯差異小的DNA片段;PAGE電泳是 _種常用的DNA檢測方法，是聚合酶鏈式反應、單鏈 構象多態（PCR-SSCP)分析中不可缺少的技術,廣泛應 用于遺傳育種、基因定位、種子活力測定等研究領域， 對于<500 bp的DNA片段分辨率極高，只相差1 bp 的片段也能分開,且可容納相對大量的DNA。研究表  

明，從PAGE中回收的DNA純度極高，可適用于分子 生物學中要求較高的實驗M。

BassamPAGE膠顯帶的常規方法，電

泳完畢后，首先用固定劑將核酸或蛋白固定到凝膠上， 然后使銀染劑中的銀離子與之牢固結合，再通過還原 劑將銀離子還原，從而發生銀棕色顯色反應。然而，實 驗中常會出現各種問題，如膠破裂、背景太深、無DNA 帶或帶紋不清晰等，它們與銀染過程中藥品使用濃度 和時間有密切關系。PAGE膠顯帶的常規方法操作繁 瑣、耗時長，改進的銀染法可降低成本，提高效率。

1 PAGE電泳影響因素

1.1 PAGE交聯度和濃度

高交聯度（丙烯酰胺：N,N'-亞甲雙丙烯酰胺為 39 :1)的PAGE電泳條帶清晰，沒有多余的細小條帶， 低交聯度（丙烯酰胺:N,N'-亞甲雙丙烯酰胺為19 :1) 的PAGE可能出現與PCR產物中與目的條帶相近的 細小條帶（俗稱影子帶），若對目的條帶不是很了解, 則不利于基因型的判斷0。

核酸PAGE電泳根據所分離的DNA片段長度需 配制不同濃度的凝膠，一般在3.5% ~20. 0%。在其 他條件相同時，條帶相近的PCR產物在高濃度的 PAGE電泳中條帶更易壓縮，更易分開,而在低濃度的 PAGE中占的體積大，條帶較彌散，不易分開，不利于 基因型的判斷;在低濃度中，同一電泳道中的多個條帶 之間的絕對距離較高濃度的絕對距離要遠，有利于基 因型的判斷17];低濃度凝膠較高濃度凝膠顯色更快。 很多試驗結果表明，用6%的凝膠分離所選標記片段, 可提高分辨率1。

1.2幾種藥品的影響

(1)過硫酸銨。過硫酸銨可引發丙烯酰胺單體發 生鏈式反應，聚合成長鏈，加入交聯劑甲叉雙丙烯酰胺 后，鏈鏈之間交聯成交聯體。一般29分子丙烯酰胺單 體聚合成1分子交聯體&]。灌完膠后，剩余膠一般5 min后顯示聚合。如30 min不凝固，則膠聚合效果不 好，可能是過硫酸銨質量不好或量少，膠板易黏膠而破 膠。如5 min以內就開始凝固，則過硫酸銨過量，會導 致梳子插入和氣泡清除困難;再則過多的過硫酸銨影 響電泳,DNA帶發虛、扭曲。為了減少過硫酸銨對電 泳的影響，一般需先進行30 min的預電泳。

(2)冰醋酸。又稱乙酸，是具有刺激性氣味的無 色液體。在銀染過程中冰醋酸主要起到兩方面的作 用，即固定和停顯。將電泳的DNA片段固定在測序膠 中，除去電泳緩沖液和凝膠中的尿素，并防止小的延伸 產物的擴散。感光材料在酸性溶液中終止顯影過程。

(3)硝酸銀。硝酸銀是無色透明片狀結晶顆粒, 其溶液中的銀離子可與核苷酸中帶負電的磷酸基團共 價結合,并在堿性環境條件下，由甲醛還原成黑褐色的 金屬銀沉積于膠中而顯示DNA帶型°8。聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染的影響因素，在染色時，應 待硝酸銀完全溶解并混勻后才將膠放入，否則銀顆粒 會潛入膠中，使背景雜亂。硝酸銀量不足會使DNA帶 變淺、失效，導致膠板變空白；量過多，導致嵌入或殘留 在膠板上的銀離子增多，背景深而影響顯帶。同一濃 度硝酸銀染色時間在30 ~40 min,顯色時間及顯色結 果無差異，當染色時間少于30 min,顯色時間需相應延 長。0.2%硝酸銀比0. 1%的硝酸銀顯帶更深、更快、 靈敏度更高9]。

(4)甲醛。甲醛溶液是一種無色、有強烈刺激性 氣味的液體。在含硫代硫酸鈉的堿性碳酸鈉溶液中甲 醛溶液將銀離子還原為金屬銀而顯色。當甲醛濃度較 高時，染色時間縮短,但膠顏色發黃，背景污濁，且相互 反差變小，使不同相對分子質量的DNA不能同步顯 色,影響靈敏度;濃度較低不僅染色時間延長而且不易 著色。由于甲醛在室溫時極易揮發，往往在實際操作 中甲醛溶液濃度不足。在不同濃度的凝膠中，使用適 當濃度甲醛配制的顯影液。甲醛濃度在0. 1%、 0.15%2% (體積比）范圍內顯色差異不大°9 ,如果 過高，則顯色速度加快，顯色程度難以控制°°。

(5)無水碳酸鈉和氫氧化鈉。無水碳酸鈉是白色 粉末狀堿性物質。在顯影液中提供堿性環境，促進顯 影劑顯影。實驗中，無水碳酸鈉溶液提前在4°C條件 下預冷，這樣可以延緩顯影時間，便于控制顯影過程及 中止反應時間，同時減少背景著色。用氫氧化鈉代替 無水碳酸鈉或提高碳酸鈉的濃度，可以使顯影時間縮 短，但背景顏色加深。1.5%和3%氫氧化鈉顯色結果 無差別,背景均較黃。

(6)硫代硫酸鈉。硫代硫酸鈉是無色棱狀晶體。 作為銀的絡合劑作用是當銀離子與核酸中帶負電的磷 酸基團等結合后與過多的游離銀離子形成可溶性絡合 物。在定影過程中硫代硫酸鈉防止自由銀離子還原為 金屬銀，減少非特異染色,以防背景加深。硫代硫酸鈉 量過多膠顏色發黃，過少則不足以螯合掉游離的銀離 子，膠顏色發黑。一般10 mg/mL的硫代硫酸鈉用量 為 100 ~200 pL/L。

1.3顯帶方法

(1)弱堿銀染法M。①固定:從垂直板電泳槽 上，取下PAGE膠板并撬開，將帶膠的平板玻璃放入 10%的冰醋酸固定液中緩慢水平搖動30 min左右，以 指示劑消失為準。固定結束后，固定液可作為定影液 留用。②漂洗：放入雙蒸水中漂洗膠版3次，每次2 min。③染色:放入0. 1%硝酸銀染色液（2 g硝酸銀 + 2 000 mL雙蒸水+3 mL甲醛溶液）中緩慢搖動染色 30 ~45 min。④漂洗:將膠板放入雙蒸水中沖洗不超 過20 s,迅速取出控水。⑤顯影:取出4C預冷的顯影 液（60 g無水碳酸鈉+ 2 L雙蒸水），加400斗 (10 mg/mL)硫代硫酸鈉溶液和3 mL甲醛溶液 (37%),充分混勻。將膠板放入，緩慢搖動，直到條帶 全顯現為止。⑥定影:將膠版放入定影液中緩慢搖動 2 min。定影液配方和固定液一樣。⑦漂洗:從定影 液中取出膠,在清水中漂洗3次,室溫晾干即可讀膠。

(2)強堿銀染法M。①固定：將平板放入固定 液（1 790 mL雙蒸餾水+200 mL無水乙醇+ 10 mL冰 醋酸）緩慢水平搖動15 min左右,以指示劑消失為準。 固定液可多次利用。聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染的影響因素，②漂洗：用雙蒸水漂洗凝膠2 次，每次2 min。③染色:膠版放入0.2%硝酸銀染液 (2 L雙蒸餾水+4 g硝酸銀）中緩慢搖動染色12 min。 ④漂洗：將膠板放入蒸餾水中沖洗5 s,迅速取出控 水。⑤顯影:把凝膠放入顯影液(2 L雙蒸餾水+30 g 氫氧化鈉+6 mL甲醛）中，緩慢搖動直到條帶顯現為 止。⑥定影:將膠板放入定影劑中2 min。⑦漂洗: 用蒸餾水漂洗膠板，置于室溫下自然涼干。

(3)簡易銀染法M。①漂洗：將帶膠的玻璃板 放入雙蒸水中漂洗15 s。②染色:膠版放入0.1%硝 酸銀中染色8 ~10 min。③漂洗:用雙蒸水漂洗2次， 每次洗10 s。④顯影:將膠板放入顯影液（30. 0 g氫 氧化鈉+ 2 L雙蒸水+6 mL甲醛）中，密切觀察顯影效 果和背景的深淺。⑤漂洗：當帶已經清晰顯出后，將 膠版放入雙蒸水中漂洗2次,室溫晾干即可讀膠。

(4)簡易快速銀染法。①染色:從垂直板電泳槽 上取下膠板并撬開，將帶膠的玻璃板放入染色液 (10%乙醇+0.5%乙酸+0.2%硝酸銀）中染色5 min。 ②顯影:將控干染色液的膠版放入顯影液中（3%氫氧 化鈉+0. 5%甲醛）顯影直至顯帶，室溫晾干即可 讀膠M。

(5)幾種顯帶方法比較。弱堿銀染法染色背景淺 帶型清晰，強堿銀染法帶型清晰但背景深;弱堿銀染法 每次染色需重新配固定液、顯影液、染色液，成本較高， 強堿銀染法染色液可以回收重復利用，固定液也可多 次利用，成本較低;弱堿法對每一步要求比較嚴格，要 求操作人員有一定的經驗，它在顯影時顯影液需預冷， 顯影效果受溫度影響大，在顯影過程后期顯影速度很 快，它要求帶型顯出時及時終止反應，如把握不當，染 色背景將迅速加深，染色效果極差，弱堿法穩定性較 差，強堿法顯影過程比較溫和，當把凝膠放入顯影液 中，最初5 min無明顯變化，在以后的10 min逐漸顯出 帶型，當帶型都顯出來后，背景顏色基本不變，顯影容 易控制，穩定性好。對于擴增很好的PCR產物，采用 弱堿法，由于背景較淺，DNA帶型會很清晰。但如果 對于那些擴增差的PCR產物，弱堿法效果較差，而強 堿法能夠提高DNA帶型和背景的對比度，使得DNA 帶型較清晰，因此,強堿銀染法比弱堿銀染法具有更高

的分辨率M。

簡易銀染法和簡易快速銀染法是在強堿法基礎上 的改進方法。簡易銀染法較常規顯帶方法節省，操作 更為方便，從時間上看，銀染只需10 min,隨后即顯影， —般只需15 min即完成DNA的顯帶過程，其速度之 快可與瓊脂糖凝膠電泳結果相比。從步驟上看，采用 改進的方法比常規顯影方法少了固定和定影等步驟， 因而操作更簡單。快速銀染法首先將固定和染色兩步 合二為一,即固定和染色反應同步進行,其次是省略了 漂洗，完成染色后，只需將染色液控干,就可直接進行 顯影，因而大大簡化了操作，此外，染色液和顯影液均 可重復使用，進一步簡化了操作，降低了成本。

弱堿法染色的背景淺，更適于觀察，目前如品種指 紋圖譜分析這類研究中一般需要盡可能區分出各種差 異片段，所以多用弱堿法M。而在分子標記輔助育種 中，需要大規模多態性檢測，聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染的影響因素，需要高效率的檢測系統，強 堿法及兩種簡易銀染法具備了省時、高效率、低成本、操 作簡便的特點,盡管強堿法染出的背景較深，但并不影 響觀察結果，因此在分子標記輔助育種中非常適用M。

2結語

PAGE是一種常用的DNA檢測方法，廣泛應用于 AFLP、SR等分析手段。聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染的影響因素，應用的關鍵是PAGE銀染技 術,很多實驗室在應用此分析手段時常常發現銀染結 果不理想，主要是染色過程中藥品出現問題或染色程 序選擇不合適。染色過程中很難對中間結果進行確 定，而且整個PAGE銀染過程涉及的藥品多而雜，不可 能對藥品進行逐個實驗。在染色結果不理想時，只能 更換全部藥品，費時費錢，所以掌握PAGE銀染技術中 各種藥品使用的濃度和作用時間非常重要。銀染程序 是影響銀染結果的另一重要因素，實驗者可根據實驗 需求使用適合的實驗程序，以達到最好的實驗效果。