生命科學和醫學領域經常需要對生命過程以 及病理生理過程中的某種基因進行表達水平上的 研究，PCR技術的問世為此帶來了便利。利用PCR 技術對生命過程中某種基因表達量變化的分析經 歷了一個從相對定量到絕對定量的過程，熒光實時 定量PCR儀的問世，使定量技術達到了一個新的 高度，實現了 PCR從定性到定量的飛躍，但是，由 于熒光實時定量PCR儀價格昂貴，限制了該儀器 在研究中的推廣使用。

事實上，在許多研究過程中只需評估樣品之間 某種基因表達水平的相對差異，半定量RT-PCR技 術完全可以滿足上述目的的研究。現階段很多實 驗室常用的半定量方法為:在進行PCR擴増后，采 用瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗結果，根據電泳條帶的 亮度來反映目的基因的豐度。由于該方法檢測的 靈敏度較低，常需要較多的循環數（>30個循環)， 而此階段為PCR擴増的平臺期，PCR產物量與起 始模板（目的基因)量己不呈線性關系，難以反映目 的基因的起始模板量，實驗結果往往出現很大的 偏差；降低循環數則因在瓊脂糖凝膠中難以檢測而 導致實驗的失敗。因此，尋找一種高靈敏的產物檢 測方法是目前進行目的基因表達差異研究的關鍵。 DNA銀染技術目前主要用于差異顯示研究，其檢 測的靈敏度接近于同位素檢測，可達到5~ 10 pg/ mm2水平[2,'結合定量PCR技術研究，有望為基因 表達水平的研究提供可靠的實驗結果，目前，還沒 有發現相關的研究報道。

本研究將聚丙烯酰胺凝膠電泳技術、銀染技術 和RPPCR相結合，以fractin基因作為內參照，通 過己知的正常組大鼠和鏈脲佐菌素致糖尿病模型 組大鼠心肌組織中葡萄糖轉運蛋白4&^〇*^腿- poiteis IV，Glu T4) mRNA水平上的差異，研究PCR 擴増循環數和起始模板量對半定量PCR分析結果 的影響，探討利用常規PCR技術進行定量分析的 最佳實驗條件。

1材料與方法

1.1實驗動物

SD大鼠，雄性，體重（200 ±20) g，購自南京醫 科大學實驗動物中心，合格證號:SCXK(蘇)2002- 0015。

1.2試劑

M-MLV 逆轉錄酶、RQ1 RNas-fi.ee DNase I 為 Pomega公司產品;Taq DNA聚合酶、RNasin和錨定 引物Oligo ( dT)18為上海生物工程技術服務有限公 司產品；其余試劑均為國產分析純。

1.3引物

葡萄糖轉運蛋白4引物序列為:上游引物5^ AGCCAGCCTACGCCACCATA 3(Td= 69. 6 °C)，下游 引物 5 GGACCCATAGCATCCGCAAC 3 (Td= 69. 1 °C)，內參照fractin的引物序列為：上游引物兮 CTTCCAGCOTCCrTCCrGG3 (Td= 67.8 °C)及下 游引物 5^ TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT 3 (Td = 69.8 °C)，均由上海申友生物技術有限責任公司合 成。

1.4儀器

GeneAmp PCR System 2400 為 Applied Biosystems 公司產品；GDS 8000 White/ Ultraviolet Transillumin;— tor•為UVP公司產品。

1.5動物模型的建立及實驗材料的獲得

SD大鼠30只，按60 mg/kg ip鏈脲佐菌素造 模，聚丙烯酰胺凝膠銀染技術在半定量中的應用，給藥體積為10 ml/kg; 2周后尾靜脈采血，用 Lifescan穩捷型血糖儀測定其血糖值，以血糖值> 16. 7 mmol/L為造模成功標準;正常飼養2個月后， 分別取模型組大鼠與正常組大鼠心臟，液氮速凍后 于-70 °C低溫冰箱中保存備用。

1.6總RNA的提取及逆轉錄

總RNA提取參照Chomczynski報道的酸性異 硫氰酸胍一步法，以無RNase的DNase消化去除 總RNA中殘余的DNA后，測定總RNA的OD260/ OD280以判斷總RNA的純度，以ODM)計算總RNA 含量，并通過甲醛凝膠電泳鑒定其完整性；逆轉錄 體系總體積為 20 W:含 10 mmol/L Tri-HCl(pH 8. 3)、15 mmol/ L IKCl、0■ 6 mmol/ L MgCl2、2 mmol/ L DTT、1. 25 mmol/ L dNTPs、20 pmol 錨定引物及 5 Ug 總RNA，經70 °C水浴5 min熱變性后加入40U RNasin、200U M—MLV 逆轉錄酶，37 °C溫育 1.5 h， 沸水浴10 min以滅活逆轉錄酶，-20 °C凍存備用。 1.7 不同循環數PCR擴增

100 Ul PCR 擴増體系包含：10 mmol/L Tri-HCl (pH 8. 8)、50 mmol/ L KCl、2. 5 mmol/ L MgCl2、0■ 5 mmol/ L dNTPs、Glu T4 引物及 l-actin 引物各 62 5 pmol、5 U Taq DNA 聚合酶、1. 0 Ug cDNA 第一鏈;94 °C熱變性3 min后進入PCR循環，PCR擴増參數如 下:94 °C變性 30 s，62 °C 退火 30 s，72 °C延伸 30 s， 共35個循環，最后于72 °C延伸10 min;分別于第 12, 16,20, 25, 30, 35個循環時各取樣15 R備用。

20 Ul 擴増體系包含：10 mmol/L Tri-HCl(pH 8. 8)、50 mmol/ L KCl、2. 5 mmol/ L MgCl2、0.5 mmol/ L dNTPs、Glu T4 引物及&actin 引物各 12. 5 pmol、1.0 U Taq DNA 聚合酶、分別加入0■ 4, 0■ 8, 1. 2,1. 6, 2.4 Ug cDNA第一鏈;94 °C熱變性3 min后進入PCR循 環，PCR循環參數如下：94 °C變性30 s，64 °C退火 30 s，72 °C延伸30 s，共25個循環，最后于72 °C延 伸 10 min。

1.9聚丙烯凝膠電泳及銀染

擴増后的PCR產物用6%變性聚丙烯酰胺凝 膠電泳檢測[3]，聚丙烯酰胺凝膠銀染技術在半定量中的應用，凝膠板面積為160 mm x 160 mm，膠 厚度為1 mm;上樣前預電泳30 min，并將樣品80 °C 熱變性5 min，上樣后以150 V電泳至二甲苯到達 凝膠3/4處終止電泳;將聚丙烯酰胺凝膠用H2O洗 滌后，置于10%乙酸中固定20 min，H2〇洗滌3次 后，加入染色液（1.0% AgN〇3/0. 0555%甲醛）染色 30 min，dH2〇洗滌20 s后加入顯色液（3. 0% Na2C〇3,0■ 0555% 甲醛，2.0 x 10- 6% Na2S2〇3)顯色 直至有清晰的條帶出現后，用10%乙酸終止反應， 用凝膠圖象分析系統對電泳結果進行掃描分析。

2結果

2.1動物模型的建立

造模兩周后，模型組大鼠的血糖升至18.76 士 1.96 mmol/L，與正常組比較具有顯著性差異（表 1)，說明造模成功。

Tab 1. Ei^ect of streptoa^tocin on the level of blood glucoserats( n = 8)

GroupsBlood glucose(mmol/L)

Normal4 01 ±0.50

Model18 76±1.96**

The rats of model group were administrated with streptozotocin (ip). The level of blood glacose in rats of the model and normal group were mea¬sured 2weeks after injecting streptozotocin. * * P< 0. 01 vs normal group

2 2 總RNA純度分析

總 RNA 經 RQ1 RNA~free DNase 處理，用 1. 0% 甲醛變性凝膠電泳，可見清楚的28S、18S條帶，而 且28S/ 18S的比值約為2: 1(圖1)，表明RNA完整 性較好。其中，模型組和給藥組總RNA的ODM/ OD280比值均在1. 8~ 2. 0之間，表明純度較高。

不同循環數對PCR擴增產物的影響

用聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染技術對不同循 環數PCR擴増產物進行了分析(圖2),并利用凝膠 圖象分析系統和LabWork 4. 0軟件對擴増結果進 行了掃描分析(表2)。

從圖2及表2中可以看出：當PCR擴増反應進 行到第16個循環時即可利用聚丙烯酰胺凝膠電泳 和銀染技術檢測到產物的存在；當PCR擴増反應 進行到第20個循環時，模型組大鼠心肌組織Glu T4基因片斷擴増產物量與內參照Hactin基因片斷 擴増量的比值為0.22,而正常組此比值為0. 31，模 型組與正常組大鼠心肌組織Glu T4基因片斷擴増 產物量己顯示出明顯的差異，即：糖尿病模型組

Glu T4 mRNA的表達量相對于正常組大鼠下調，與 報道的情況一致16];在30和35個循環中，模型組 GluP4/f-actin的比值與正常組此比值的差異變小，

并趨于一致。

 

Fig 2 RT-PCR products at differential cycles a^ialvzed with polyaciylamide gel elertiophoresis

Lane1: DL2000 DNA marker; Lane 2, 4, 6，8，10，12: indicate respectively the results of normal group' s PCR product at the 12，16, 20, 25, 30, 35 th cycle;Lane 3，5，7，9，11，13: indicate respectively the results of model

group’ s PCR product at the 12，16, 20, 25, 30,35 th cycle

由上述分析，我們初步確定25個循環數為半 定量PCR分析中采用的最佳循環數，聚丙烯酰胺凝膠銀染技術在半定量中的應用，并比較了銀 染方法和EB染色方法對25和30個循環的PCR產 物的檢測效果，發現EB染色的方法不能檢測到25 個PCR循環的產物（圖略)。 

Tab 2. Expression level of Gla T4 a^id actin gene of rats in the normal a^id model groups

Cycles of PCR121620253035

N MNMNMNMNMNM

Glu T4( %)- ---12. 39 8420.811.316 617 214. 112. 5

£-actin( %)--16 818 439. 645.342.534.723 127 718. 316. 9

Glu T4/£-actin- ---0 310 220. 490.330. 720. 620 770 74

The expression level of Glu T4 and 3-artin gene of rats in the normal and model groups were analyzed by LabWork 4. 0• N: normal group;M:model group

 

2. 4起始模板量對定量分析的影響

根據“2. 3”項的分析結果，我們確定了定量分 析中的PCR擴増循環數為25個循環，并以此分析 了不同起始模板量與產物量之間的關系。

在20 Ul PCR擴増體系中分別加入0. 4, 0. 8, 1.2, 1. 6, 2. 4作逆轉錄產物，經過25個循環，Glu T4與!-actin的擴増產物量均隨模板量的増加而増 的線性關系（圖3及表4)。

3討論

匍萄糖轉運蛋白 4( glucose transporters IV，Glu

加，且Glu T4/f-actin的值與起始模板量呈現較好細胞中的表達下調，從而減少葡萄糖的跨膜轉運，影響心肌細胞的能量代謝過程，并最終引起糖尿病心 肌病。本研究根據上述穩定的病理模型，探討了 半定量PCR方法在病理分析過程中的應用，并對該 方法在病理分析中應用的條件進行了優化。

本研究屬于多重PCR的范疇，Mullis等認為： 就多重PCR的研究而言，聚丙烯酰胺凝膠銀染技術在半定量中的應用，較高的模板量、Mg2+以及 dNTPs均有助于多重PCR的成功11]。因此，我們在 本項研究中采用的Mg2+為2 5 mmol/ L, dNTPs濃度 為0. 5 mmol/L,均高于普通PCR反應，并取得了良 好的擴増效果。

就定量分析而言，要使PCR產物量能夠較好 地反映起始模板量，必須對處于指數擴増階段的產 物進行檢測，而它是不能通過EB染色檢測到的， 這是在利用常規PCR方法分析目的基因表達變化 過程中常遇到的難題，大多數實驗室常將定量分析 過程中的PCR擴増循環數提高到30甚至35個循 環，但是，往往導致實驗失敗，因此，尋求一種高靈 敏度的檢測核酸數量變化的方法是關鍵。常用于 低豐度核酸檢測的方法是同位素方法，但該方法易 污染、周期長以及需要特殊設備，限制了它的應用； DNA銀染技術則是另外一種高靈敏度的核酸檢測 方法，與同位素方法相比，其克服了同位素法的不 利因素，檢測靈敏度與同位素法相當，達到檢測5 ~ 10 pg/mm2核酸水平[2]，目前該方法己被廣泛應 用于mRNA差異顯示的研究中，但尚未發現在 DNA(或mRNA)定量分析中應用的報道。

I 2 3 4 5 ^

2(KK)-^ ^

 

25(i— ^

Fig 3 Result of polyacrylamide gel electrophoresis of Ri-PCR products with differential quantities of templates

Lanel: DL2000;Lane 2, 3, 4, 5, 6: indicate respectively the results of PCR with different quantities of template at the 25th cycle 

Tab 3. Effects of different quantities of template on the quantities of PCR pioducts( n= 3)

GroupsTemplate(Ug/Ul)

0.40 81. 21.62 4

Glu T4-2.21 + 0. 603. 28±0 404. 10 ±0. 437 51 ± 0.59

f—actin11. 11 ±4.3316.35+2. 0317. 52 ± 2 1618.91 ±2. 5020 85 ±2. 32

Glu T4/ £-actin-0. 13+0. 020. 19 ± 0 010.22 ±0. 010 36 ± 0.02

The quantities of PCR products will different quantities of template were analy疋d at the 25th cycle by LabWork 4 0

 

在PCR擴増循環數確定后，需要考慮擴増體 系中的起始模板量對最終分析結果的影響。我們大小的差異。因此，我們認為，在對它們的豐度大

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染技術，我們對 不同循環數（12~ 35)的PCR產物進行了分析，發 現在第12個循環時即可檢測到PCR產物的存在， 這是EB染色方法所不能達到的，根據對擴増動力 學的研究，12~ 25個循環內，PCR擴増仍處于指數 擴増期，因此，在此循環數范圍內，可以較為準確地 通過比較產物量來判斷起始模板量的差異，但是， 考慮到凝膠圖象分析系統檢測的靈敏度，我們建議 在進行DNA(或mRNA)定量分析時，將循環數控制 在20~ 25個循環以內，以保證分析結果的穩定性 和可靠性。

分析了 0. 8~ 2.4 Wg模板量對分析結果的影響，結 果證明：聚丙烯酰胺凝膠銀染技術在半定量中的應用，在此范圍內，目的基因GluT4與內參照基 因f-actin的擴増產物量均隨模板量的増加而増 加，且Glu T4/&actin的比值與起始模板量呈現較 好的線性關系，起始模板濃度可以較為準確地通過 產物量來反映。

在進行目的基因的定量分析過程中尚需考慮 目的基因和內對照基因的豐度、大小以及它們的引 物長短對擴増反應的影響，Mullis等認為內對照基 因的豐度與目的基因的豐度不宜相差太大[1]，否則 會影響到分析的準確性，但是，在分析過程中往往 很難兼顧到不同時期目的基因與內對照基因豐度 小判斷比較困難的情況下，可以考慮選擇細胞中組 成型表達的基因作為內對照基因，如:f-actin以及 GDPH等，由于這些基因的表達一般很少受到其它 因素的影響，因此，可以在一定程度上直接反映細 胞內的狀態。我們以f-actin為內對照基因并獲得 了較為滿意的結果。到目前為止，還沒有發現關于 目的基因與內對照基因的大小差異對定量分析結 果產生影響的報道，一般在進行分析的過程中僅考 慮到兩者的差異可以通過電泳檢測即可，為便于在 凝膠中的檢測，建議兩者間的差異最好介于100~ 400 bp間，該差異可以通過PAGE膠或2.0%的瓊 脂糖凝膠進行檢測；目的基因和內對照基因的引物 長短和堿基組成對半定量分析的結果影響較大，聚丙烯酰胺凝膠銀染技術在半定量中的應用，由于兩對引物是在同一個擴増體系中進行PCR反 應，因此，兩引物的長短和堿基組成最好相近，即引 物應具有相似的Td值，本研究中選擇的Td值為 (68. 8 ± 1.0) °C，保證了擴増條件的一致性。

本研究僅就Glu T4基因在糖尿病發生過程中 表達的變化進行了分析。

總之，在一定的起始模板量范圍內，將PCR擴 増循環數控制在25個循環以下，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染技術，可以利用PCR方法較為準 確地研究目的基因的表達水平。