陽性對照用0.7%丙烯酰胺交換，實驗 組分別用2倍濃度的培養(yǎng)液和H2〇稀釋IT及FH 至50%、25%和12.5%,每孔2004交換，然后置入 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于第2天、4天及6天各 取出一塊培養(yǎng)板，每孔加入20W的MT T溶液，繼續(xù) 培養(yǎng)4 ~ 6小時，然后，棄去孔內(nèi)液體吸出聚丙烯酰 胺水凝膠。每孔加入150ul DMSO。振蕩10分鐘， 用酶聯(lián)檢測儀在490nm波長檢測光吸收值（OD)， 取4孔平均值。按照下列公式計算相對増殖率 (Relative growth rate, RGR)4]。

RG R=實驗組吸光值x 100 %

RGR=寸照組吸光值100 %

然后根據(jù)RGR值按以下標(biāo)準(zhǔn)評分定出材料的

毒性級別： 評分相對增殖率（％)

0級>100

1級75 ?99

2級50 ?74

3級25 ?49

4級1?24

5級0

2結(jié)果

2.1相差顯微鏡觀察3種不同濃度的兩個受試

物組在加藥后第2、4、6天的細(xì)胞形態(tài)與陰性對照組 細(xì)胞形態(tài)基本相同，聚丙烯酰胺水凝膠對細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究,呈梭形或三角形，貼壁良好，生 長旺盛。陽性對照組細(xì)胞在加藥后第2天有近1/3 死亡，余下的細(xì)胞貼壁生長不良，細(xì)胞圓縮。第4天 時90%的細(xì)胞死亡。

表1國產(chǎn)及進(jìn)口聚丙烯酰胺水凝膠及對照組的吸光值(OD) x±s

材料2日吸光值4日吸光值6日吸光值

聚閃烯酰胺濃度x 士 sx 士 sx 士s

空白對照組0.58±0.011 60士0 071 97 士0 09

IT112. 50.56 士 0.081.46 士 0. 131 79 士0 09

IT2250.54 士 0. 121. 33 士 0.071 76 士0 07

IT3500 .52士0 .021. 36 士 0.031 79 士0 13

FH112. 50.57 士 0.071 35士0 061 80 士0 08

FH2250 55士0 181. 39 士 0. 141 76 士0 11

FH3500 52士0 201 40士0 081 90 士0 08

陽性對照0.22 士 0.030. 14 士 0.030 05 士0 04

聚丙烯酰胺各組之間及與陰性對照組比P> 0. 05,陽性對照與陰性對照組比0. 01

表2相對增殖率及毒性評分

材料2日吸光值4日吸光值6日吸光值

聚丙烯酰胺濃度（％)RGR評分RGR評分RGR評分

空白對照組100010001000

IT112 596 6191 2190 91

IT22593 1183 1189 31

IT35089 7185190 91

FH112 598 3184 4191 31

FH22594 8186 9189 31

FH35089 7187 5196 41

陽性對照0 737 938 7542 534

 

3討論

31關(guān)于MTT法目前，世界上己有多種細(xì)胞毒 性試驗方法被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)材料的毒性評定，如瓊脂 覆蓋法，同位素標(biāo)記法(51心-、3只、125^4只)，分子濾過 法，細(xì)胞増殖度法，細(xì)胞形態(tài)觀察法及細(xì)胞圖像分析 儀定量法等5。1983年Mosmann[6]首次報道了 一' 種新的快速評定細(xì)胞増殖和細(xì)胞毒性的比色分析法

MTT試驗法。1987年Twentyman[?l等報道

用MTT檢測細(xì)胞活性，并認(rèn)為可以代替活細(xì)胞計 數(shù)、同位素標(biāo)記法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗。MTT是一種 能接受氫原子的染料，化學(xué)名為3 —（4 5 —二甲基 噻唑一 2)—2.5—二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑 藍(lán)。其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使 外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，并 沉積在細(xì)胞中，而死亡細(xì)胞無此功能。DMSO能溶 解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在 490nm波長處測定其吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù) 量。由于結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)量及其活性成正 相關(guān)，聚丙烯酰胺水凝膠對細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究,通過比色、測定光吸收值(OD)，可計算出各實 驗組細(xì)胞相對増殖率，即可反映出細(xì)胞的數(shù)量及其 活性。該方法靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便、經(jīng)濟、 快速，無放射性污染，與細(xì)胞計數(shù)和核素?fù)饺氲确椒?有良好的相關(guān)性[8,故我們采用了此方法。MTT 實驗結(jié)果顯示:加入3個濃度的進(jìn)口與國產(chǎn)聚丙烯 酰胺水凝膠的L929細(xì)胞在培養(yǎng)2日、4日、6日的 MTT結(jié)晶顯示：國產(chǎn)聚丙烯酰胺與進(jìn)口聚丙烯酰胺 兩者及它們各自3種不同濃度的MTT結(jié)晶形態(tài) 上，數(shù)量上無明顯區(qū)別，與所測的OD值相符，但隨 著培養(yǎng)時間的延長，MTT結(jié)晶不斷増多，這一點也 是符合L929細(xì)胞的増殖規(guī)律的，也與我們所測的 OD值相一致。

3.2關(guān)于聚丙烯酰胺的毒性醫(yī)用聚合物材料一

般要同體液相接觸，聚合物本身通常是沒有毒性的， 聚丙烯酰胺水凝膠對細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究,引起炎癥和組織反應(yīng)的主要原因是聚合物中的易溶 出物質(zhì)。這些易溶出物質(zhì)一般包括殘留的原料單 體、低分子聚合物、催化劑和其它添加劑等等。動物 試驗雖可反應(yīng)出醫(yī)用聚合物溶出物的毒性情況，但 要定量地考察出聚合物溶出物對生物的影響則是比 較困難的。而體外細(xì)胞培養(yǎng)精確性、敏感性均較高， 有可能大量提供在同一時期、條件相同、性狀相似的 實驗樣本[8]，既可減少在哺乳動物身上進(jìn)行的聚合 物材料模擬實驗的昂貴費用，又能避免因動物來源 不同而造成的影響。因而可用體外細(xì)胞培養(yǎng)來評價 聚合物中可能存在的低分子量的物質(zhì)及聚合物中可 溶出物的細(xì)胞毒性影響。

本實驗采用標(biāo)準(zhǔn)的成纖維細(xì)胞株L929在三個 濃度組份的進(jìn)口及國產(chǎn)聚丙烯酰胺培養(yǎng)液中用倒置 顯微鏡及MTT法觀察比較結(jié)果顯示，各個濃度的 IT和FH對L929細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞生長有抑制作 用，對細(xì)胞形態(tài)亦無明顯影響。IT、FH相對増殖速 度較大，均屬RGR分級標(biāo)準(zhǔn)1級，幾乎沒有毒性，判 為合格，顯示了國產(chǎn)及進(jìn)口聚丙烯酰胺作為軟組織 填充材料有較好的安全性。聚丙烯酰胺水凝膠對細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究,且國產(chǎn)聚丙烯酰胺與進(jìn) 口產(chǎn)品相比未見毒性上明顯差異，安全指標(biāo)上達(dá)到 同類進(jìn)口產(chǎn)品要求。實驗中所見細(xì)胞在加有聚丙烯 酰胺的培養(yǎng)液中貼壁生長良好，可能是由于聚丙烯 酰胺在性質(zhì)上相當(dāng)于細(xì)胞間質(zhì)，支持了細(xì)胞的生長。 據(jù)報告1967年烏克蘭的微生物學(xué)家和細(xì)胞學(xué)家應(yīng) 用聚丙烯酰胺水凝膠作為細(xì)胞培養(yǎng)基，同時證明該 種材料對細(xì)胞無毒性，微生物和細(xì)胞可在該種材料 內(nèi)生長和分裂。這一結(jié)論還有待進(jìn)一步實驗證實。