聚丙烯酰胺凝膠銀染技術改良：
聚丙烯酰胺凝膠銀染技術改良，聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種常用的DNA檢測 方法，對于小于500 bp的DNA片段分辨率極高，長 度僅僅相差0.2 %(即500 bp中的1 bp)的DNA分子
也可被分開，且容納的DNA量遠遠大于瓊脂糖凝 膠。研究表明，從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純 度極高，可適用于分子生物學中較高要求的實驗(如 鼠胚微注射)[1?3]。但其制備、操作繁瑣，電泳結束 后染色過程也較為費時、費力。作者在工作中針對 變性與非變性兩種聚丙烯酰胺凝膠銀染方法各自最 適條件進行了探討和改良，使之更加快捷、方便。
1材料與方法
1.1變性聚丙烯酰胺凝膠銀染法選用80 g/L聚
丙烯酰胺凝膠(含變性劑的尿素)分離159?196 bp DNA分子。電泳結束后，取出膠板，小心剝離并置
于固定液(含體積分數10 %乙醇，體積分數0. 5 %乙 酸)中輕搖固定3 min后，放入染色液（以固定液稀 釋20 g/L硝酸銀貯存液至2 g/L使用濃度)染色5? 8 min，雙蒸水漂洗2次，每次不超過2 min，顯影液5 ?10 min至條帶清晰后使用固定液定影10 min，雙 蒸水漂洗數次即可。顯影液為30 g/L氫氧化鈉與 適當濃度甲醛的混合溶液，分別使用體積分數為 0. 2 %，0. 5 %及1. 0 %的甲醛，比較其顯影結果。
*河南省醫學科技創新人才工程項目（2000)84
1.2非變性凝膠銀染方法選用80 g/L不含變性 劑的聚丙烯酰胺凝膠分離336 bp DNA片段。取出 膠板，入體積分數10 %乙醇輕搖固定5?10 min，雙 蒸水漂洗2次后置體積分數1 %硝酸5 min，雙蒸水 漂洗2次，使用2 g/L硝酸銀染色30 min，三蒸水洗 膠板2次，每次均少于1 min，入新鮮配制的顯色液 (500 ml中含無水碳酸鈉15 g，甲醛500 pl，硫代硫酸 鈉5 g)輕搖直至條帶出現，如需拍照，可將處于最佳 顯色狀態的凝膠入體積分數10 %乙酸終止顯色。
實驗過程中，分別使用常溫下和4 n水預冷的顯影 液進行顯色。
2結果與結論
2. 1顯影液中甲醛濃度對聚丙烯酰胺凝膠顯色的
影響DNA經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，使用3種由 不同濃度甲醛配制的顯影液后均出現相應條帶，顯 色速度隨甲醛濃度增大而逐漸縮短。其中變性膠經 快速銀染后以體積分數0. 5 %甲醛配制的顯影液顯 影效果為最佳，略顯黃色，顯色時間為7 min,相應條 帶均清晰可見，對比度良好，適于拍照或進行計算機 圖像分析。相比較,含體積分數為0. 2 %甲醛的顯 影液顯色所用時間較長，12 min左右出現結果，在 DNA條帶出現同時，凝膠背底也逐漸加深,二者對 比較小。而體積分數1.0 %甲醛濃度顯影液顯影時 間明顯縮短,3 min即可顯色，聚丙烯酰胺凝膠銀染技術改良，對于DNA帶型，其相 互反差較小，層次感較差，因而分子量較小的DNA 不能同步顯色，影響檢測的敏感性。故認為,使用適 當甲醛濃度配制的顯影液，對于增加聚丙烯酰胺凝 膠電泳敏感性與特異性將具有重要的作用。
2.2顯色液溫度對顯色結果的影響作者分別使 用室溫與4 C左右的顯影液,顯影效果以預冷的顯 影液為最佳,其顯色時間為10 min左右,DNA條帶 清晰，反差明顯，且背景較淺。聚丙烯酰胺凝膠銀染技術改良，溫度較高可以加快顯 色速度,5 min出現條帶,同時升高背景，提示顯色液 溫度的高低可影響顯色反應的速度以及背景的 高低。
2.3變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染分析變性聚
丙烯酰胺凝膠電泳適用于微衛星位點雜合性缺失分 析。電泳后采用快速銀染方法，所需時間少于30 min,同常規染色方法相比大大縮短了銀染時間，顯 影使用氫氧化鈉,5?10 min即可顯示條帶,優點在 于省時，便于及時固定分離DNA條帶并銀染直觀觀 察。操作過程中應合理控制漂洗及顯影時間，及時 終止反應，否則膠板本底加深,對于進一步分析條帶 產生影響。
2.4非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染分析非變
性聚丙烯酰胺凝膠電泳多用于DNA測序及單鏈構 象多態性分析,聚丙烯酰胺凝膠銀染技術改良，不宜采用快速銀染法,染色過程中尚 需注意：①所用試劑除顯影液外均可多次回收使用， 倒液時應避免染色沉淀物接觸膠板；②票洗過程中 盡量避免膠板置于空氣的暴露時間過長，以防背景 過深,同時應使用雙蒸水或去離子水充分漂洗；③顯 影液應新鮮配制，使用前應冰浴至4?8 C左右。該 染色方法具有條帶清晰，背底淺等優點。
聚丙烯酰胺凝膠電泳為分子生物學實驗中常用 技術之一。凝膠亦可采用溴化乙錠（EB)染色，經紫 外燈下觀察,其優點在于操作簡便，同時可直接切下 純化DNA片段。但聚丙烯酰胺凝膠會熄滅EB熒 光，故不能檢出少于10 ng的DNA分子，加之EB具 強烈神經毒性并污染環境，與之相比,銀染法毒性及 污染小，并易于長期保存。目前已有學者[4]將需回 收純化的DNA樣品點樣于相鄰泳道,與銀染條帶對 應部位切下純化,即解決了以往銀染后DNA條帶回 收純化較復雜的問題，因而，聚丙烯酰胺凝膠電泳后 進行銀染分析,必將在分子生物學領域得到更為廣 泛的應用。而銀染過程中樣品DNA含量，染色液濃 度，時間,漂洗及終止時間的長短皆影響膠板的染色 深淺,在不同實驗條件下應進行細心摸索，以期達到 最佳效果。
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