是在 AFLP技術的基礎上發展起來的一種實用的功能基因組研究方法[12]，可對生物體轉錄組進行全面、系統的分析;具有重復性高、假 陽性低、穩定、可靠等優點；且不需要預先知道序列信息，所需儀器設備也較為簡單[3].聚丙烯酰胺凝膠電 泳是cDNA-AFLP分析的重要技術環節，但cDNA-AFLP選擇性擴増產物的片段長度跨度較大，從幾十個堿 基至近千個堿基.采用常規的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳往往造成底部條帶之間的距離比頂部的大，致使膠 板的上部出現大片段條帶堆積，而下部小片段條帶間距過大，聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的改進及其在分析中的應用，能讀出的條帶數有限，從而影響了 cDNA- AFLP的分析效果.本研究在Sheen和Seed電解質梯度膠的基礎上[4]，首次利用電解質梯度變性聚丙烯酰 胺凝膠電泳技術，對稻縱卷葉螟取食的水稻葉片進行cDNA-AFLP分析，得到的條帶清晰、可辨，較好地滿 足了 cDNA-AFLP等高通量分析對大分子分辨率的要求.

1材料與方法

1 1供試材料

11. 1植物材料水稻“明恢86”恢復系由福建農林大學遺傳所提供，稻縱卷葉螟4齡幼蟲采自福建農 林大學教學試驗農場水稻田.

1 1 2試劑與儀器丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、過硫酸銨、四甲基乙二胺、防止粘膠均購自Amre- co公司;促使粘膠購自Amersham;冰乙酸、硝酸銀、甲醛、無水碳酸鈉、硫代硫酸鈉均為國產分析純.

三恒電泳儀（JY-ECP3000)為北京君意公司產品；電泳槽（DYCZ-20B型，25 cm x50cm)為北京六一儀 器廠產品.

12方法

1 2 1電泳樣品的制備 cDNA-AFLP程序參照Bachem et al1]的方法進行設計.對稻縱卷葉螟4齡幼蟲 

取食的水稻“明恢86”恢復系葉片提取總RNA;反轉錄成雙鏈cDN人并用限制性內切酶AseI和TaqI切 割，將切割后的產物與cDNA-AFLP接頭連接；以接頭序列和相鄰的限制性位點序列作為引物的結合位點. 采用PCR方法對目的序列進行擴増.取5UL選擇性擴増產物與5UL上樣緩沖液（loadhgbufer)混合，95 °C水浴5 mi^迅速取出樣品置于冰上，立即點樣，或將樣品置-20 °C冰箱中存放備用.同時設空白對照.

1 2 2聚丙烯酰胺凝肢溶液的配制聚丙烯酰胺凝膠溶液的配制參照薩姆布魯克等[4]的方法.質量分數 為45%的丙烯酰胺儲液由434 g* L-1丙烯酰胺和16 g，L-1甲叉雙丙烯酰胺按29: 1混配；10 xTBE由 108 g. L- 'Tiis堿、55 g. L-1硼酸和40 mL 0 5mol. L-1的EDTA組成.不同含量梯度的聚丙烯酰胺凝膠 溶液的配制見表1

12 3電解質梯度變性聚丙烯酰胺凝肢電泳表1不同含量梯度聚丙烯酰胺凝膠溶液的配制

Table 1 Dosage of the solation of polvraciylan ide gelwith different mass fractions

w聚丙烯酰胺凝膠45%質量分數的聚 丙烯酰胺儲液/mL10 x TBE mL水/mL尿素/g

48 91045. 842

511 11043.042

613 31041. 142

817 81036.942

肢板的制作制膠玻板洗凈后用酒精擦拭，晾 干.將300 UL促使粘膠涂到大玻板上，聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的改進及其在分析中的應用，將300 UL防止粘膠涂到小玻板上;將干凈的墊片置 于大玻板的兩側，再用夾子將玻板夾緊;取50 mL的聚丙烯酰胺凝膠溶液置于燒杯中，加入 25UL的TEMED和1650UL的過硫酸銨，充

分攪勻后，用50mL的注射器吸取、灌膠，再將

鯊魚齒梳子的平端插入玻璃板間約5mm;將嵌在丙烯酰胺凝膠中的鯊魚齒梳拔出并清洗干凈，同時用0 5x

TBE緩沖液沖洗拔出梳子的膠面，將梳子重新反向插入膠面中，鯊魚齒梳深入膠中約1mm處.

12 4電泳在上槽加入0 5xTBE緩沖液;下槽加入1份NaAc( 3mol* L-〗洱=7 0)和2份1 xTBE 緩沖液，采用微量進樣器（趕出膠孔中氣泡）取5 UL處理好的樣品點樣后電泳.電泳條件：75W恒功率， 105 m in 1 2 5銀染參照文獻[5]的方法進行銀染，將帶膠的玻璃板放到固定液中輕搖40min取出玻璃板并回 收固定液，用去離子水沖洗玻璃板3次，再放入去離子水中輕搖10mh左右;取出玻璃板，用去離子水清 洗1次，聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的改進及其在分析中的應用，再放入質量分數為0. 1%的硝酸銀染色液中輕搖30 min;取出玻璃板，用去離子水清洗10- 20 s 放入顯影液中輕搖，直至出現清晰的條帶;將回收的固定液倒入，終止顯影，搖至氣泡不再產生為止.

2結果與分析

2 1電解質梯度變性聚丙烯酰胺凝膠和普通變性聚丙烯酰胺凝膠的電泳效果比較

從圖1可看出：用常規的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，膠頂部條帶擁擠，大片段條帶分辨率低;而用電解 質梯度變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，則頂部條帶間距離較大，條帶清晰，可分辨的條帶數大大増加.

2 2不同含量電解質梯度變性聚丙烯酰胺凝膠的電泳結果

采用表1中不同含量的聚丙烯酰胺凝膠溶液進行電解質梯度變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗，結果表 明：質量分數為40%和80%的聚丙烯酰胺凝膠溶液的電泳效果較差，聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的改進及其在分析中的應用，質量分數為50%和60%的聚丙 烯酰胺凝膠溶液電泳效果較好（圖2)，條帶均較清楚.

3討論

cDNA-AFLP分析過程中cDNA條帶數越多，越容易找到差異表達的基因，以及從整體上揭示基因表 達譜對環境的響應.由于所采用的限制性內切酶在基因編碼序列中的分布是隨機的[67]，因此，采用一對 限制性內切酶切割雙鏈cDNA后所產生的酶切片段的長度分布通常為幾十個堿基至近千個甚至數千個以 上堿基.在常規的聚丙烯酰胺凝膠電泳條件下，聚丙烯酰胺凝膠電泳中DNA的遷移率與其片段的長度呈 對數關系，當小分子質量的DNA片段遷移至近膠底部時，頂部的條帶還很擁擠（圖1A)，且底部小片段間 距離太大.通過延長時間使頂部條帶分開，會導致玻璃板溫度過高，膠及玻璃板均容易斷裂.而采用電解質 梯度變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠自身的含量不變，只是通過上下槽緩沖液時在膠中產生離子強度梯 度.由于通過凝膠的電壓隨離子強度的提高而降低，使膠底部電壓降低，DNA接近凝膠底部時移動減慢， 底部條帶間距離逐漸縮短，而頂部條帶間距離逐漸拉開.利用此方法可使單塊凝膠上能讀取的DNA條帶 數増加30%左右（圖1B)，不需要常規變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中長達40min的預電泳，從而節約了大量 時間和能量.dm-AHP分析通常采用的凝膠的質量分數為晚，但從圖2可看出在本試驗條件下采用I

質量分數的凝膠分離幾十至近千個堿基的DNA的效果更好.

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