瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測：

瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測，瓊脂糖凝膠和5%(w/v)的聚丙烯酰胺凝膠電泳對小麥白粉病抗、感特 性品種基因組DNA的RAPD檢測結果表明：5%聚丙烯酰胺凝膠對線性DNA分子(0■ 1~ 2.0kb)和 長度相差100bp以下的DNA分子的分離較2.0%的瓊脂糖凝膠電泳效果好。因此，我們研究出 了 I項利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測小麥白粉病抗、感特性的新技術，在工作中建立了 |種適合 于檢測小麥基因組DNA結構差異的電泳方法。該方法主要包括:（1)丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯 酰胺的新配比;（2)分離DNA片段的最佳凝膠濃度;（3)電泳條件;（4)脫色、漂洗、銀染、顯色過 程。實驗發現，該技術對于小麥白粉病抗、感特性檢測中的小片段和長度相差100bp以下的線性 DNA PCR擴增結果的分辨效果較好。應用該技術在抗感品種間已經發現了 DNA水平上的差異。 關鍵詞小麥白粉病瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳

瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel， PAG)電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的標準方 法[1]。二者相比較聚丙烯酰胺分離小片段DNA( 5 ~ 500bp)效果最好，瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測，其分辨力極高，用于測序的聚 丙烯酰胺凝膠可分離相差1bp的DNA片段，而且 聚丙烯酰胺凝膠所能裝載的DNA量可以是瓊脂糖 凝膠的幾倍，從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純 度也比瓊脂糖凝膠高，可用于序列分析[1]。但與瓊 脂糖凝膠相比，其制備和操作更為困難。

我們通過用2.0%的瓊脂糖、5%聚丙烯酰胺凝 膠對小麥白粉病抗、感特性品種基因組DNA的 RAPD擴増結果進行了比較分析，經過方法技術改 進，最終確定了一種簡單、適宜的聚丙烯酰胺凝膠 電泳方法，這一方法己在我們的研究中應用，取得 了較為滿意的結果。

1材料與方法

1.1供試小麥種子

供試材料共兩份:感病親本普通小麥京411;

抗病雜交后代4112//015^腦]^5(8匚2卩5)是抗病親 本普通小麥Brock和感病優良品種015雜交后，再 和感病優良品種普通小麥京411回交2次后，自交 4次從而得到的第5代種子。種子材料由中國農 業大學提供。

1.2主要試劑及儀器

瓊脂糖(Agarose)、丙烯酰胺(Acr)、亞甲基雙丙 烯酰胺（Bis)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、N，N，N"， N-四甲基乙二胺(TEMED)均購自上海生物工程公 司；硼酸（borio acid)、乙二胺四乙酸二鈉鹽 (EDTANa2)、氫氧化鈉(NaOH)、過硫酸銨(AP)均為 國產分析純。

恒壓恒流DF^D型電泳儀(北京東方特力科貿 中心)，DYY- II型水平電泳槽，雙垂直板電泳槽(膠 板面積200mm x 200mm，北京六一廠產），間隔片，

梳子夾子若干。

13小麥總體DNA的提取與RAPD隨機擴增

1. 3. 1小麥總體DNA的提取各取材料10粒，經 安替福民消毒，瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測，自來水浸泡使之吸漲后22~ 24°C閉 光培養至黃化苗長至5~ 6cm即可。DNA的提取參 閱 StwaitJe CN. (1994)和 Mcdonald M. B. (1994)酚、 仿抽提，乙醇沉淀的方法，略作改動。

檢測后作為PCR擴増的模板。擴増條件參考 Williams^2]和Welsh[4]的方法，略作改動：總體系為 25W，各組分物質的含量分別為template 20ng; 1〇x Buffer 2. 5Wl; MgCl2 0.3mmol/L; dNTP 0.2mmol/L; primer iym〇V L; Taq 1 ■ 5U，ddH2〇 補齊 25W，混勻，離 心收集，在PTC-150^25上進行反應，反應程序參考 Wang Xinyu[5]的方法略作改動:96 °C變性1min，35 °C 退火1min，72 °C延伸2min，3個循環，94 °C變性45s， 36°C退火1min，72°C延伸90s，共45個循環，最后 72°C 補齊 10min。

1.4瓊脂糖凝膠制備及電泳系統

1.4.1緩沖液貯液制備貯液用50 x TAE: Tiis 24. 2g，冰醋酸 5.71ml，0■ 5m〇l/L EDTA( pH8. 0) 10ml

加蒸餾水至100ml配制。用時稀釋50倍。

1.4.2凝肢配比2.0%的瓊脂糖凝膠0.4g瓊脂 糖力卩1xTAE 20ml。配膠時加入染色劑溴化乙錠 (EB 1mg/ml) 1W。

1.4.3 電泳上樣量8W，50V電壓電泳1.5h，終

止電泳。電泳后用紫外反射透射分析儀在透射光 下觀察并照相。

1.5聚丙烯酰胺凝膠制備及電泳系統

1.5.1緩沖液貯液制備貯液用5x TBE: Tiis 54g，硼酸 27. 5g，0■ 5mol/L EDTA( pH 8.0) 20ml 加蒸 餾水至1000ml配制。用時稀釋5倍。

1.5.2凝肢母液制備母液用40% Acr: Acr7%， Bis 2g加蒸餾水至200ml配制。

1.5.3適合本實驗的凝肢配比40% Acr 4ml，5 x TBE 6ml，H2O 21.5ml，AP 0.06g，TEMED 20^l。

1.5.4 電泳上樣量6W，55V電壓電泳12h，終止 電泳。環境溫度以15~ 24°C為宜。

1.5.5染色、顯色將凝膠加入到1% AgN〇3

250ml(含375W甲醛）中，染色30min; 250ml蒸餾水 漂洗一遍;加入30%預冷的Na2C〇3(含375W甲醛 和0.5mg的硫代硫酸鈉)250ml顯色至出現清晰的 DNA銀染條帶;最后加入10%冰醋酸250ml終止反 應，然后照相或制干膠保存。

2結果與分析

2.1 PAGE系統的改進

2.1.1確定Acr和Bis的配比 PAGE作為一種常 用的蛋白質分析技術[6]，適用于低分子量蛋白質 至少包含29個丙烯酰胺單體，凝膠中網格的孔徑 由Acr和Bis的相對比例決定，其中亞甲基雙丙烯 酰胺的濃度越低，孔徑越大。適用于分離大分子物 質[7]。不同研究者所使用的凝膠中Acr與Bis的比 例相差較大。在蛋白質研究中李愛芬等[8]比較了 Acr 和 Bis4 種不同比例（30: 0.8, 50: 1，100: 1，150: 1)的分離膠對裙帶菜色素蛋白質復合物的電泳效 果的影響，發現不同的Acr和Bis比例對電泳分離 結果沒有顯著影響，但分離膠中若Ac•和Bis的比 例太大，如100 1以上，分離膠太軟，電泳后膠條不 容易剝離。由于本實驗希望在幾百到一、兩千屮 范圍得到較好的分離效果，需要孔徑稍大的聚丙烯 酰胺凝膠就可滿足分離要求。并參考微衛星DNA 電泳時的凝膠配比，最終確定了 39: 1的Acr與Bis 比例作為最終配比，足以得到清晰的條帶。

2.1.2最佳凝肢濃度參考劉峰等[9]的微衛星 DNA電泳時的凝膠配比，我們先后以4 5%、5%、 6%、％的聚丙烯酰胺濃度電泳分析RAPD擴増結 果，發現膠濃度為4 5%時，膠稀軟，濃縮效應差， 操作難;隨著膠濃度的増大對小片段DNA的分離 效果提高，相近分子量DNA片段的分辨力増強，但 隨著膠濃度的加大，無論怎樣増加電泳時間，一些 大片段DNA都會滯留在凝膠的上端，從而影響對 大片段的分析。瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測，而且膠濃度為6%、％的凝膠脆 硬，拔梳子時容易損壞樣池。最終確定以5%的聚 丙烯酰胺凝膠作為最佳的膠濃度，凝膠透明、富有 彈性、孔徑適中、操作容易、分辨力恰當、譜型清晰 (見圖 2A，B，C)。

2.1.3電泳條件凝膠的厚度（間隔片的厚度)可 以介于0. 5~ 2mm之間，但由于凝膠越厚，電泳時 產生的熱量越大，過熱會導致出現“微笑”DNA條 帶;過薄又不利于操作。因此，我們選用1mm作為 最佳膠濃度。電泳時采用55V低壓過夜電泳的方 法，進一步防止高壓產生熱量，出現“微笑”帶。用 此方法得到的分離結果DNA條帶最尖銳、最平坦。 (見圖 2A，B，C)。

2.1.4脫色、銀染、顯色過程Ag+與核酸形成穩 定復合物，然后用甲醛使Ag+還原成銀顆粒。硝酸 銀等試劑可使聚丙烯酰胺上的單鏈DNA染成黑褐 色。而且銀染的靈敏度比EB高200倍左右[7]。由 于本實驗使溴酚藍前沿離開凝膠約0.5h，因而省去 了冰醋酸脫色和水洗的過程，使原來的1. 5h的脫

(低于刪。1個交職的聚丙烯酰胺分子，色水洗、銀染、顯觸程咸少到0■ 5h。經過對比結

果相同。

2.2高濃度瓊脂糖（2%)與適宜濃度聚丙烯酰凝 膠(5%)電泳的結果比較

兩種材料利用同一引物經RAPD擴増后，對比 兩種凝膠電泳結果可以看出聚丙烯酰凝膠優于瓊 脂糖凝膠主要在兩點：

2.2.1可以清晰地分辨相差10Cbp以下的片段 在瓊脂糖凝膠電泳中，我們經常會遇到RAPD的擴 増結果出現拖尾、背景高、條帶模糊等現象（見圖 1A)，于是人們就致力于改變各種參數如模板 DNA、Taq酶、MgCl2和dNTP[1〇]或影響因素如循環 參數、PCR緩沖液及反應體積[11]對PCR擴増結果 形成影響，而本實驗是從另一個角度，即改變電泳 方式，從而使未顯現的條帶顯現出來。用比EB染 色更為靈敏的銀染方式檢測產物，得到了較好的分 離效果。如引物S2095、S2094、S1191、S1197的擴増 結果在2.0%的瓊脂糖凝膠中形成了拖尾、具背 景、條帶模糊等現象，但在聚丙烯酰凝膠中擴増結 果得到了很好的分離，這可能是因為篩孔小的瓊脂 糖凝膠無法分離相差小的擴増條帶。以引物S2095 在感病親本和抗病雜交后代中的RAPD擴増電泳 結果為例：2 0%瓊脂糖凝膠在1. 6、1.2、0. 9、0.8、 0.7kb左右各出現一條帶，0.7kb以下帶型模糊； 5%的聚丙烯酰胺凝膠除在1.6、1.2、0.9、0. 8、0. 7cb 左右出現條帶夕卜，在1.9、1.3、0.88、0.83、0.6、 0.564、0. 1kb左右出現明顯條帶。

2.2.2分辨范圍廣2 0%的瓊脂糖凝膠屬高濃度 的膠，其有效分離范圍是0.1~ 2kb[1]。但事實上 500bp左右的帶型己不清晰。如引物S2096、S64、 S2084、1190(見圖1B)。瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測，適宜濃度聚丙烯酰凝膠是 5%的膠，雖然它的有效分離范圍是80~ 50Cbp[7]， 但在實驗中發現，其在0. 08~ 2kb的范圍內也能得 到很好的分離效果。因而，彌補了高濃度瓊脂糖凝 膠的不足。實驗證明，在80bp左右，銀染過后條帶 仍清晰可見。（見圖2B)以引物S2096在感病親本 和抗病雜交后代中的RAPD擴増電泳結果為例： 2.0%瓊脂糖凝膠在2 2、1. 58、1. 1、0. 9kb左右各出 現一條帶；5%的聚丙烯酰胺凝膠除在1. 58、1.1、 0.9、0. 5kb左右出現條帶夕卜，在1.37、0.96、0. 94、 0. 83、0. 8、0. 7、0. 1kb左右出現明顯條帶，而且 0.5kb的帶型在5%的聚丙烯酰胺凝膠上呈現出了 5%的聚丙烯酰胺凝膠在0.08~ 2kb的范圍內都可 對線性PCR結果進行有效地分離，比瓊脂糖凝膠

電泳具有更大的分辨力。

表1部分引物在兩種凝膠系統中分辨力的比較

2. 0(%Vv) Agarose( kb)5(%V v) PAG( kb)5(%w/v)PAG 比 2.0 (%w/ v) Agaose 增 加的條帶（條）有無抗感、 性差異

1.9

1.61.6

1.3

1.21.2

0.90.9

S20950. 88

0. 837無

0. 80. 8

0.70.7

0.6

0. 564

0. 1

1.581.58

1. 37

1.11. 1

0. 96 0. 94

S20960.90.99無

0. 83 0. 8 0.7 0. 56 0. 55 0. 1

1.71.7

1.481. 48

1.31.3

1. 25

S20910. 983有

0.90.9

0. 98

0. 84

0.7

2.3應用高濃度瓊脂糖(2%)與適宜濃度聚丙烯 酰凝膠(5%)對白粉病抗感特性小麥品種檢測的比 較

利用25個RAPD隨機引物的PCR擴增結果進

行2 0%瓊脂糖凝膠和5%的聚丙烯酰胺凝膠電 泳。發現聚丙烯酰胺凝膠電泳的DNA條帶數目（6 ?14條)多于瓊脂糖凝膠電泳（1?8條）。其中17 個引物無論是2.0%瓊脂糖凝膠電泳結果還是在

清晰的兩條帶，即a56和0■55kb左右的。很明顯，5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果在感病親本和抗病

雜交后代中擴增帶型相同（如圖2A, B, C),也就是膠電泳結果中，除1.7、1.48、1. 3、0. 9kb左右的條帶

說沒有發現DNA水平上的差異。但其中有8個引外,0.98、0.84、0.7kb左右有條帶。值得注意的是

物，S2091. S2093. S1184, S1187, S377, S461, S465、 S1196在2. 0%瓊脂糖凝膠電泳結果相同，即抗病 親本和感病雜交后代的擴增帶型相同，但在5%的 聚丙烯酰胺凝膠中帶型出現差異，瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測，即抗病親本和感 在0. 7kb處Brock抗病雜交后代出現一條明顯條 帶,而感病親本京411中完全沒有這條帶,而這些 研究結果在用瓊脂糖電泳方法檢測時，沒有顯示出 差異。利用5%的聚丙烯酰胺凝膠分離擴增結果,

病雜交后代在DNA水平上出現差異。以S2091的由于其對小分子量DNA片段的分辨力強,可能會

擴增結果為例,2. 0%瓊脂糖凝膠中，在1.7、1. 48、得到用2%的瓊脂糖凝膠分離得不到的結果。

 

圖1引物S2095( A)、S2096( B)、S2091( C)在抗、感品種間RAPD擴增的瓊脂糖凝膠(2 0%)結果

 

圖2引物S2095( A)、S2096(B)、S2091( C)在抗、感品種間RAPD擴增的聚丙烯酰胺凝膠(5%)結果

圖 1、圖 2 中加樣順序為 M: LambdaDNA/ECoRl + HindIIlMarker;1:京411;2:BC2F5

1.3、1.25、0. 9kb各有一條帶,5%的聚丙烯酰胺凝膠。

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