聚丙烯酰胺凝膠配制：30%和40%丙烯酰胺里面 丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例是不一樣的 具體用哪種看你想跑多大分子量的蛋白 而不應隨意使用 希望能對你的實驗有所幫助
聚丙烯酰胺凝膠配制的配方要看你配多大體積的膠2ml？3ml？5ml？
聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質。聚丙烯酰胺凝膠配制是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N'-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學聚合和光聚合?；瘜W聚合通常是加入催化劑過硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨產生自由基：以R·代表自由基，M代表丙烯酰胺單體，這樣由于乙烯基"CH2=CH－"一個接一個的聚合作用就形成丙烯酰胺長鏈，同時甲叉雙丙烯酰胺在不斷延長的丙烯酰胺鏈間形成甲叉鍵交聯，從而形成交聯的三維網狀結構。氧氣對自由基有清除作用，所以通常凝膠溶液聚合前要進行抽氣。丙烯酰胺的另一種聚合方法是光聚合，催化劑是核黃素，核黃素在光照下能夠產生自由基，催化聚合反應。一般光照2－3小時即可完成聚合反應。
聚丙烯酰胺凝膠配制的孔徑可以通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控制，丙烯酰胺的濃度可以在3％－30％之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3％的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質沒有明顯的阻礙作用，可用于平板等電聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質有分子篩的作用，可以用于根據蛋白質的分子量進行分離的電泳中，如10％－20％的凝膠常用于SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個重要參數T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個單體的總百分濃度。C是與T有關的交聯百分濃度。T與C的計算公式是： C = 6.5－0.3T
上式中a為丙烯酰胺的克數，b為甲叉雙丙烯酰胺的克數，m為水或緩沖液體積（ml）。式中a與b的比例很重要。富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的重量比應在30左右。選擇T和C的經驗公式是：
此式可用于計算T為5％～20％時的凝膠組成。C值并不很嚴格，在大多數情況下，可變化的范圍約為 ±1％，當C保持恒定時，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當T保持恒定，C為4％時，有效孔徑最小，C大于或小于4％時，有效孔徑均變大，C大于5％時凝膠變脆，不宜使用，實驗中最常用的C是2.6％和3％。
聚丙烯酰胺凝膠配制配成30％的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1個月，在貯存期間丙烯酰胺會水解為丙烯酸而增加電泳時的電內滲現象并減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對中樞神經系統有毒的試劑，操作時要避免直接接觸皮膚，但它們聚合后則無毒。
聚丙烯酰胺凝膠配制未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性，對于生物大分子的鑒定有重要意義，其方法是在凝膠上進行兩份相同樣品的電泳，電泳后將凝膠切成兩半，一半用于活性染色，對某個特定的生物大分子進行鑒定，另一半用于所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。
由于聚丙烯酰胺凝膠有突出的優點，因而四十年來得到廣泛的應用，目前尚無更好的支持介質能夠取代它。其主要的優點有：①可以隨意控制膠濃度"T"和交聯度"C"，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。②能把分子篩作用和電荷效應結合在同一方法中，達到更高的靈敏度：10－9 ～10－12 mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝膠是由－C－C－鍵結合的酰胺多聚物，側鏈只有不活潑的酰胺基－CO－NH2 ，沒有帶電的其他離子基團，化學惰性好，電泳時不會產生"電滲"。④由于可以制得高純度的單體原料，因而電泳分離的重復性好。⑤透明度好，便于照相和復印。機械強度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。⑥無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析。⑦還可以用作固定化酶的惰性載體。
聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質最初是在玻璃管中進行的，玻璃管通常直徑為7 mm，長10 cm，將凝膠裝入到多個管中進行電泳，又稱為柱狀電泳。目前仍有應用，尤其用于二維電泳中的第一維電泳。但由于各個玻璃管的不同以及裝膠時的差異使每管的分離條件會有所差異，所以對各管樣品進行比較時可能會出現較大誤差。后來發展起來的垂直平板電泳一次最多可以容納20個樣品，電泳過程中樣品所處的條件比較一致，樣品間可以進行更好的比較，重復性也更好，所以垂直平板電泳目前應用的更為廣泛，常用于蛋白質及DNA序列分析過程中DNA片段的分離、鑒定。
水平平板電泳近年來也有很快的發展，與垂直平板電泳相比也有其獨特的優點：①由于凝膠可以直接鋪在冷卻板上，容易使凝膠冷卻，因而可以加高電壓以提高分辨率。②電泳速度快，通常只要1小時左右，而園盤電泳和垂直平板電泳一般需要3～4小時。③因為可以使用薄膠，加樣少，染色快，從而提高了靈敏度，而且容易保存，只要用甘油浸泡后自然干燥即可長期保存不會龜裂。④便于適用各種電泳方式，用途廣泛，尤其是可以使用90年代才發展起來的只有水平電泳系統才能使用的新的半干技術，即用浸有少量緩沖液的半干的膠條代替通常所用的大量電極緩沖液，大大節約了試劑，簡化了操作，提高了電泳速度。
聚丙烯酰胺凝膠配制制備過程：
1、 按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出。
2、 將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角。
3、 按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數。
4、 加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時為止。
5、 立即插入適當的梳子，密切注意防止梳齒下產生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄漏的機會。
6、 室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1XTBE緩沖液。
7、 小心取出梳子，加樣。
原理：在SSCP測定中，雙鏈DNA（dsDNA）被變性成為單鏈DNA（ssDNA），每一條單鏈DNA都基于它們的內部序列而呈現出一種獨有的折疊構象，即使同樣長度的DNA單鏈因其堿基順序不同、甚至單個堿基的不同會形成不同的構象。這些單鏈DNA在非變性條件下，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，單鏈DNA的遷移率和帶型，都取決于其折疊構象和電泳時的溫度。
SSCP與變性凝膠電泳基本一致，不同之處有以下幾點：
a． SSCP使用非變性凝膠進行電泳，即在凝膠配制中不加入變性劑。我室常用8%非變性膠（丙烯酰胺 80g，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L）
b． 工作環境，由于SSCP受溫度影響，所以在電泳過程中應防止溫度的升高，所以電泳環境為電壓400V，電流50mA，單板電泳功率為9W，不用預熱。緩沖液最好用新配制的。
c． 由于電泳功率較低，所以電泳時間較長，通常需要10小時以上，因此一般電泳需要過夜。室溫在25。C以下。
1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量的蛋白質，小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析裝載的樣品容量大，可回收，DNA純度高。在催化劑TEMED（N-N-N，- N，-四甲基乙二胺）和過硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯劑，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺的參與下，聚丙烯酰胺鏈與鏈之間交叉聯結形成凝膠。
1.1 聚丙烯酰胺凝膠配制配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g
N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 1g
加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月
1.2 聚丙烯酰胺凝膠配制配制5×TBE緩沖液：
TRIS堿 54克
硼酸 27.5克
EDTA 3.72克
加水至1L
1.3 制備聚丙烯酰胺凝膠所用試劑體積
試劑
制備不同濃度（%）凝膠所用試劑體積（ml）
3.5
5.0
8.0
12.0
20.0
30%丙烯酰胺
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
水
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%過硫酸銨
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝膠中有效分離范圍
丙烯酰胺（%）
有效分離范圍（bp）
二甲苯氰FF
溴酚藍
3.5
1000-2000
460
100
5.0
80-500
260
65
8.0
60-400
160
45
12.0
40-200
70
20
15.0
25-150
60
15
20.0
6-100
45
12
2. 聚丙烯酰胺凝膠電泳具體步驟
2.1從NaOH池中撈出浸泡的玻璃板，取出上面的殘膠
2.2 把玻璃板拿到流動水處洗刷干凈
2.3 洗干凈的玻璃板至于玻璃板架上晾干
2.4 用乙醇擦洗玻璃板
2.5 帶凹口的背板涂上硅化劑，面板則涂上粘合劑，防止電泳完畢發生撕膠和脫膠的可能（涂摸要均勻）
2.6 面板在下，背板在上。兩側用塑料板密封，并用夾子夾好。底部調節使之水平
2.7 將加入催化劑后的凝膠沿凹口均勻倒下，插入適當的封條。勿使封條下留下氣泡。用夾子夾緊封條部位
2.8 室溫聚合30分鐘，小心取出凹口處封條，用水沖洗加樣孔（否則封條所殘留的丙烯酰胺在加樣孔聚合產生不規則表面，引起DNA帶變形）
2.9 將凝膠固定在電泳槽里。帶凹口背板朝里，面向緩沖液槽
2.10 用0. 5×TBE灌滿電泳槽的緩沖液槽，接上電極，打開電源。調試工作環境為電壓2000-2200V，電流150-200mA，單板電泳功率為80W。預熱30分鐘左右。
2.11 點樣之前需切斷電源，用槍將點樣孔的氣泡及膠吹出，然后插入點樣梳，注意不要插得太深，否則點樣膠面會變形，影響美觀及點樣。
2.12槍吸加樣品，PCR產物先加loading buffer 10ul ,再變性5分鐘左右，接著在冰水中冷卻5分鐘以上方可點樣，點樣完畢，電泳開始。
2.13 電泳至所需位置后，切斷電源，拔出導線，回收緩沖液，卸下玻璃板。在工作臺上，將背板撬起，放回原處。將面板進行銀染
3. 電泳后的銀染檢測
3.1 原理：
影像產生是由于核酸在膠上所占部位與周圍的氧化——還原勢不同而產生。銀染液中的銀離子（Ag+）可與核酸形成穩定的復合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，這樣核酸電泳帶就染成了黑褐色。
3.2 銀染
銀染液的配制：稱2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水
銀染:將電泳完的面板首先在銀染漂洗盆了漂洗趕緊，使膠面上沒有異物。玻璃板反面沒有污染物。
將加入銀染液的銀染盆放在搖床上后，將面板放入銀染1小時左右。
3.3 顯影
顯影液的配制：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml
顯影：將面板從銀染盆里取出，在銀染漂洗盆里漂洗，震蕩5-6次，取出后使其表面盡量無水，再放入已加入顯影液的顯影盆里（顯影，顯影液的配制及甲醛的加入都需要在通風櫥的搖床上進行）顯影過程大約10到15分鐘，以DNA條帶清晰可見為準。
將顯現完畢的板子在顯影漂洗盆里漂洗后，方可讀帶。
本實驗室聚丙烯酰胺凝膠配制相關常用試劑配方：
1. 我實驗室常用的聚丙烯酰胺凝膠是6%變性聚丙烯酰胺凝膠（簡稱變性膠，PAGE），就是在普通聚丙烯酰胺凝膠中加入變性劑。我們使用的變性劑是尿素。
6%PAGE具體配制方法為:
尿素210g，10×TBE 25ml ，丙烯酰胺28.5 g ，亞甲雙丙烯酰胺 1.5g，加水定容至500ml，過濾后使用。
考慮到方便使用的問題，一般一次配制2L（尿素840g，10×TBE100ml，丙烯酰胺114g，亞甲雙丙烯酰胺6g）。
2. 10×TBE（Tris-硼酸-EDTA）的配制
EDTA 7.44g，硼酸55g，Tris 108g，加水定容至1000ml
3. 10%過硫酸氨（AP）
10g過硫酸氨，純水定容至100ml
4. 硅化劑配方
二甲基二氯硅烷：無水乙醇=13ml：500ml
5. 反硅化劑（粘合劑）配制
無水乙醇 500ml（一瓶），44ddH2O，3.3冰醋酸，550ul Bind silnce（3，-Trimethoxysilyl propyl）
配置完遮光4。C保存
6 loading buffer 配制
0.1g 二甲苯氰，0.1g 溴酚藍，1ml 0.5molEDTA ，100mL甲酰胺
1．目的
學習SDS-PAGE的基本操作，學會用SDS-PAGE檢測蛋白。
2．原理
蛋白質在加熱變性以后與SDS結合，帶上負電荷，在電場的作用下，向正極移動，結果按分子量大小排列在膠板上，含量多的蛋白帶紋粗。
3．器材
旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面離心管架，臺式冷凍離心機，制冰機，超聲波破碎儀，電磁爐，電泳儀，垂直電泳槽及配套的玻璃和密封條、梳子等，搖菌試管，三角燒瓶，接種環，飯盒。
4．試劑
SDS（十二烷基磺酸鈉），Acr（丙烯酰胺），Bis（N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺），Tris（三羥甲基氨基甲烷），甘氨酸，鹽酸，Aps（過硫酸氨），TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量標準（97.4，66.2，43，31，20.1，14.4 kDa），溴酚藍，甘油，冰醋酸，乙醇，b-2-巰基乙醇，考馬斯亮藍R250，甲醇，乙醇。
5．實驗準備
1.0mol/L Tris HCl，pH8.8（4°C保存）；0.5mol/L Tris HCl，pH6.8（4°C保存）；10%SDS（室溫保存）；30%Acr/Bis（30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100mL，4°C保存）；10%Aps （-20°C保存）；2´上樣緩沖液（0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2mL，甘油2mL，20%SDS 2mL，0.1%溴酚藍 0.5mL，b-2-巰基乙醇 1.0mL，dd water 2.5mL，室溫存放）；5´電泳緩沖液（Tris 7.5g ，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加dd water至500mL，使用時稀釋五倍）；考馬斯亮藍染色液（考馬斯亮藍R250 0.25g + 45ml甲醇+10mL冰醋酸，用dd water定容至100mL）；脫色液（95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，體積比）；
6．操作步驟
（1） 將表達后的菌體與2´上樣緩沖液按1：1混勻于微量離心管中。
（2） 用超聲波破碎儀脈沖10次，每次10秒。中間間隔時放入冰中降溫。注意一定要將超聲波探頭插入容液底部，在溶液表面或上部時容易起泡！
（3） 將上述微量離心管插入水漂中，放在電磁爐鍋里的沸水中煮3~5min。然后立即插入冰中。（可在-20°C冰柜中保存）。
（4） 組裝電泳玻璃并用細橡膠管密封底部和側面然后用夾子夾?。ㄓ^察教師的演示）。插入梳子后在玻璃上距離梳子齒底部1cm的地方做一個標記。
（5） 配制10%分離膠。按順序和量取下列溶液混在一個50mL的小燒杯中（注意Tris為 pH8.8）：
Acrylamide-bis 3.96 mL
1M Tris PH8.8 4.38 mL
d.d Water 3.432 mL
10% SDS 118.8 mL
TEMED 9.9 mL
10%APS 118.8 mL
（6） 加完APS后拿起燒杯輕輕轉動幾下底部將溶液混勻后，立刻緩緩倒入玻璃夾縫中，直到液面與所作的標記齊平。剩下的膠液留在小燒杯中，傾斜放置。然后在上部用1000ml微量移液器輕輕地沿玻璃壁來回移動加滿dd water（盡可能不破壞下面的膠液）。然后靜置30min。直到燒杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸餾水，并倒置玻璃盡可能將水倒盡。
（7） 配支持膠。按順序和量（注意體積單位！）取下列溶液混在一個50mL的小燒杯中（注意Tris為 pH6.8）：
Acrylamide-bis 0.675 mL
0.5M Tris pH6.8 0.563 mL
dd water 3.165 mL
10% SDS 45 mL
TEMED 7.5 mL
10% APS 45 mL
（8） 加完APS后拿起燒杯輕輕轉動幾下底部將溶液混勻后，立刻倒入玻璃夾縫中，液面與玻璃上邊緣齊平。然后再慢慢插入梳子，靜置約20min。燒杯中剩下的溶液傾斜放置直到溶液凝固。（此狀態可以用塑料薄膜包起來放入冰箱過夜）。
（9） 小心拔出梳子以后，用注射器針頭（剪平尖部）吸取梳子齒形成的加樣槽中的水，并修平加樣槽底部的膠面。
（10） 選取幾個形態好的加樣槽，在一張紙上做好對應的標記，用微量移液器在側面的一個加樣槽中加入20mL 蛋白分子量，其它槽中加入10～20mL自己制作的樣品。
（11） 加完樣品后，再用微量移液器吸取電泳緩沖液小心把加樣槽液面都補平。電泳槽上部倒滿電泳緩沖液（約250ml,淹沒過加樣槽的液面?。?，電泳槽的下部倒入一半電泳緩沖液（約180ml）。
（12） 接好電極，將電流調至10mA，待溴酚藍移到分離膠后，在將電流調至18mA，電泳約2~3h，期間隨時觀察電泳槽上部的液體是否有泄漏（泄漏導致液面下降，電流中斷）！當溴酚藍移到玻璃距底部0.5cm時切斷電源。
（13） 在一個搪瓷盤里準備適量的考馬斯亮藍染色液。
（14） 倒掉電泳槽中的緩沖液，取下玻璃，小心用鏟子從下部將帶有缺口的玻璃板撬起（切不可損壞膠?。Ｓ苗P子切去上部的支持膠，并把分離膠從玻璃上剝離倒染液搪瓷盤里（切不可損壞膠！）。
（15） 染色2h后，在將染液倒回瓶子里以備重復使用。在飯盒里倒入脫色液，過夜。
（16） 觀察脫色后膠里的藍色帶紋，與對照比較或尋找異常粗的帶紋，并比較其分子量，判斷是否是預期的基因產物。
（17） 清理桌面，寫實驗報告。
0% acrylamide-bisacrylamide（丙烯酰胺：雙丙烯酰胺=29:1）的水溶液是你說的那個東西，標準的叫法是30%Acr-Bis，但有時為了簡便就直接叫30%ACR了，不過為了與丙烯酰胺區別開（畢竟還含有雙丙烯酰胺嘛）就把y也加上了。
兩種方法原理不同，有差異是正常的。如果差距較大，要仔細分析。
一般凝膠層析是非變性的，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是變性的，二硫鍵也被還原，所以是亞基（肽鏈）分子量。
凝膠層析與分子形狀有關，一般marker都是球狀蛋白，所以測球狀蛋白分子量較準。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與分子形狀無關。
有些蛋白性質特殊，不適于用SDS-凝膠電泳法測定。比如結構特殊的，如膠原；帶很多電荷的，如組蛋白；帶有較大輔基的，如糖蛋白。
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