大家好，我是山東東達聚合物有限公司的技術員小王，今天來給大家詳細的介紹一下聚丙烯酰胺凝膠配方：
聚丙烯酰胺凝膠配方，丙烯酰胺有效分離（bp)二甲苯青溴酚藍丙烯酰胺30%（ml）10×TBE（ml)ddH2O（ml） TEMED（µl） 過硫酸銨10%（µl）
3.5%100-10004601005.83539.1725.0250
5.0%100-500260658.33536.6725.0250
8.0%60-4001604513.33531.6725.0250
12.0%40-200702020.0525.0025.0250
15.0%25-150601525.0520.0025.0250
20.0%5-100451233.33511.6725.0250
5ml體系：
丙烯酰胺丙烯酰胺30%
（ml）10×TBE
（ml） ddH2O
（µl） TEMED
（µl）過硫酸銨10%
（µl）
3.5%0.5830.53.9172.525
5.0%0.8330.53.6672.525
8.0%1.3330.53.1672.525
12.0%2.000.52.52.525
15.0%2.500.52.02.525
20.0%3.3330.51.1672.525
1、丙烯酰胺30%為29：1（質量比，丙烯酰胺：雙甲叉丙烯酰胺）
2、TEMED 可以加到1ul/ml。
不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍表
丙烯酰胺(%)有效分離范圍(bp)溴酚蘭*二甲苯青*
3.5100～2000100460
5.080～50065260
8.060～40045160
12.040～2003070
15.025～1501560
20.010～1001245
*表中給出的數字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對數目(bp).
聚丙烯酰胺凝膠配方，凝膠的制備過程：
1、 按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出。
2、 將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角。
3、 按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數。
4、 加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時為止。
5、 立即插入適當的梳子，密切注意防止梳齒下產生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄漏的機會。
6、 室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1XTBE緩沖液。
7、 小心取出梳子，加樣。
6%的聚丙烯酰胺凝膠配方：30%聚丙烯酰胺（29：1）8ml,5*TBE 8ml,尿素16.8g,定容至40ml,加10%過硫酸銨200ul,TEMED20ul,室溫凝固時間大于1小時
聚丙烯酰胺凝膠配方，而30%聚丙烯酰胺：丙烯酰胺29克，甲叉丙烯酰胺1克，水100ml
10%過硫酸銨：過硫酸銨1克，水10ml
5*TBE :Tris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(PH8.0)10ml,定容至500ml
聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支撐介質。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N'-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合進程需求有自由基催化完結。常用的催化聚合辦法有兩種：化學聚合和光聚合。化學聚合一般是參加催化劑過硫酸銨（AP）以及加快劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨發生自由基：以R·代表自由基，M代表丙烯酰胺單體，這樣因為乙烯基"CH2=CH－"一個接一個的聚合效果就構成丙烯酰胺長鏈，同時甲叉雙丙烯酰胺在不斷延伸的丙烯酰胺鏈間構成甲叉鍵交聯，然后構成交聯的三維網狀結構。氧氣對自由基有鏟除效果，所以一般凝膠溶液聚合前要進行抽氣。丙烯酰胺的另一種聚合辦法是光聚合，催化劑是核黃素，核黃素在光照下能夠發生自由基，催化聚合反應。一般光照2－3小時即可完結聚合反應。
聚丙烯酰胺凝膠的孔徑能夠通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來操控，丙烯酰胺的濃度能夠在3％－30％之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3％的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質沒有顯著的阻止效果，可用于平板等電聚集或SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也能夠用于別離DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質有分子篩的效果，能夠用于根據蛋白質的分子量進行別離的電泳中，如10％－20％的凝膠常用于SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的別離膠。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強度、彈性、通明度、粘度和孔徑巨細均取決于兩個重要參數T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個單體的總百分濃度。C是與T有關的交聯百分濃度。T與C的計算公式是： C = 6.5－0.3T
上式中a為丙烯酰胺的克數，b為甲叉雙丙烯酰胺的克數，m為水或緩沖液體積（ml）。式中a與b的份額很重要。賦有彈性，且徹底通明的凝膠，a與b的重量比應在30擺布。選擇T和C的經歷公式是：
此式可用于計算T為5％～20％時的凝膠組成。C值并不很嚴厲，在大多數情況下，可改變的規模約為 ±1％，當C堅持恒守時，凝膠的有用孔徑跟著T的添加而減小，當T堅持穩定，C為4％時，有用孔徑最小，C大于或小于4％時，有用孔徑均變大，C大于5％時凝膠變脆，不宜運用，試驗中最常用的C是2.6％和3％。
聚丙烯酰胺凝膠配方配成30％的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保留1個月，在貯存時間丙烯酰胺會水解為丙烯酸而添加電泳時的電內滲表象并減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對中樞神經體系有毒的試劑，操作時要防止直接觸摸肌膚，但它們聚合后則無毒。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠使生物大分子在電泳進程中堅持其天然的形狀和電荷，它們的別離是根據其電泳遷移率的不一樣和凝膠的分子篩效果，因此能夠得到較高的分辨率，特別是在電泳別離后仍能堅持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性，關于生物大分子的判定有重要意義，其辦法是在凝膠上進行兩份一樣樣品的電泳，電泳后將凝膠切成兩半，一半用于活性染色，對某個特定的生物大分子進行判定，另一半用于所有樣品的染色，以剖析樣品中各種生物大分子的種類和含量。
因為聚丙烯酰胺凝膠有突出的優點，因此四十年來得到廣泛的運用，當前尚無非常好的支撐介質能夠替代它。其主要的優點有：①能夠隨意操控膠濃度"T"和交聯度"C"，然后得到不一樣的有用孔徑，用于別離不一樣分子量的生物大分子。②能把分子篩效果和電荷效應聯系在同一辦法中，到達更高的靈敏度：10－9 ～10－12 mol/L。③因為聚丙烯酰胺凝膠是由－C－C－鍵聯系的酰胺多聚物，側鏈只需不生動的酰胺基－CO－NH2 ，沒有帶電的其他離子基團，化學慵懶好，電泳時不會發生"電滲"。④因為能夠制得高純度的單體質料，因此電泳別離的重復性好。⑤通明度好，便于照相和復印。機械強度好，有彈性，不易碎，便于操作和保留。⑥無紫外吸收，不染色就能夠用于紫外波長的凝膠掃描作定量剖析。⑦還能夠用作固定化酶的慵懶載體。
聚丙烯酰胺凝膠配方別離蛋白質開始是在玻璃管中進行的，玻璃管一般直徑為7 mm，長10 cm，將凝膠裝入到多個管中進行電泳，又稱為柱狀電泳。當前仍有運用，特別用于二維電泳中的榜首維電泳。但因為各個玻璃管的不一樣以及裝膠時的區別使每管的別離條件會有所區別，所以對各管樣品進行對比時可能會呈現較大差錯。后來開展起來的筆直平板電泳一次最多能夠容納20個樣品，電泳進程中樣品所在的條件對比共同，樣品間能夠進行非常好的對比，重復性也非常好，所以筆直平板電泳當前運用的更為廣泛，常用于蛋白質及DNA序列剖析進程中DNA片段的別離、判定。
水平平板電泳這些年也有很快的開展，與筆直平板電泳比較也有其共同的優點：①因為凝膠能夠直接鋪在冷卻板上，簡單使凝膠冷卻，因此能夠加高電壓以進步分辨率。②電泳速度快，一般只需1小時擺布，而園盤電泳和筆直平板電泳一般需求3～4小時。③因為能夠運用薄膠，加樣少，染色快，然后進步了靈敏度，并且簡單保留，只需用甘油浸泡后天然枯燥即可長時間保留不會龜裂。④便于適用各種電泳方法，用處廣泛，特別是能夠運用90年代才開展起來的只需水平電泳體系才干運用的新的半干技能，即用浸有少數緩沖液的半干的膠條替代一般所用的大量電極緩沖液，大大節省了試劑，簡化了操作，進步了電泳速度。
凝膠電泳作為檢測DNA序列差異的有效手段，變性凝膠電泳在我室廣泛使用，但是也有其使用范圍。在我室還有一種常用的非變性凝膠電泳技術，簡稱SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism，單鏈構象多態性）。
原理：在SSCP測定中，雙鏈DNA（dsDNA）被變性成為單鏈DNA（ssDNA），每一條單鏈DNA都基于它們的內部序列而呈現出一種獨有的折疊構象，即使同樣長度的DNA單鏈因其堿基順序不同、甚至單個堿基的不同會形成不同的構象。這些單鏈DNA在非變性條件下，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，單鏈DNA的遷移率和帶型，都取決于其折疊構象和電泳時的溫度。
SSCP與變性凝膠電泳基本一致，不同之處有以下幾點：
a． SSCP使用非變性凝膠進行電泳，即在凝膠配制中不加入變性劑。我室常用8%非變性膠（丙烯酰胺 80g，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L）
b． 工作環境，由于SSCP受溫度影響，所以在電泳過程中應防止溫度的升高，所以電泳環境為電壓400V，電流50mA，單板電泳功率為9W，不用預熱。緩沖液最好用新配制的。
c． 由于電泳功率較低，所以電泳時間較長，通常需要10小時以上，因此一般電泳需要過夜。室溫在25。C以下。
1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠配方電泳適宜分離鑒定低分子量的蛋白質，小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析裝載的樣品容量大，可回收，DNA純度高。在催化劑TEMED（N-N-N，- N，-四甲基乙二胺）和過硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯劑，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺的參與下，聚丙烯酰胺鏈與鏈之間交叉聯結形成凝膠。
1.1 配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g
N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 1g
加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月
1.2 配制5×TBE緩沖液：
TRIS堿 54克
硼酸 27.5克
EDTA 3.72克
加水至1L
1.3 制備聚丙烯酰胺凝膠所用試劑體積
試劑
制備不同濃度（%）凝膠所用試劑體積（ml）
3.5
5.0
8.0
12.0
20.0
30%丙烯酰胺
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
水
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%過硫酸銨
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝膠中有效分離范圍
丙烯酰胺（%）
有效分離范圍（bp）
二甲苯氰FF
溴酚藍
3.5
1000-2000
460
100
5.0
80-500
260
65
8.0
60-400
160
45
12.0
40-200
70
20
15.0
25-150
60
15
20.0
6-100
45
12
2. 聚丙烯酰胺凝膠配方，聚丙烯酰胺凝膠電泳具體步驟
2.1從NaOH池中撈出浸泡的玻璃板，取出上面的殘膠
2.2 把玻璃板拿到流動水處洗刷干凈
2.3 洗干凈的玻璃板至于玻璃板架上晾干
2.4 用乙醇擦洗玻璃板
2.5 帶凹口的背板涂上硅化劑，面板則涂上粘合劑，防止電泳完畢發生撕膠和脫膠的可能（涂摸要均勻）
2.6 面板在下，背板在上。兩側用塑料板密封，并用夾子夾好。底部調節使之水平
2.7 將加入催化劑后的凝膠沿凹口均勻倒下，插入適當的封條。勿使封條下留下氣泡。用夾子夾緊封條部位
2.8 室溫聚合30分鐘，小心取出凹口處封條，用水沖洗加樣孔（否則封條所殘留的丙烯酰胺在加樣孔聚合產生不規則表面，引起DNA帶變形）
2.9 將凝膠固定在電泳槽里。帶凹口背板朝里，面向緩沖液槽
2.10 用0. 5×TBE灌滿電泳槽的緩沖液槽，接上電極，打開電源。調試工作環境為電壓2000-2200V，電流150-200mA，單板電泳功率為80W。預熱30分鐘左右。
2.11 點樣之前需切斷電源，用槍將點樣孔的氣泡及膠吹出，然后插入點樣梳，注意不要插得太深，否則點樣膠面會變形，影響美觀及點樣。
2.12槍吸加樣品，PCR產物先加loading buffer 10ul ,再變性5分鐘左右，接著在冰水中冷卻5分鐘以上方可點樣，點樣完畢，電泳開始。
2.13 電泳至所需位置后，切斷電源，拔出導線，回收緩沖液，卸下玻璃板。在工作臺上，將背板撬起，放回原處。將面板進行銀染
3. 電泳后的銀染檢測
3.1 原理：
影像產生是由于核酸在膠上所占部位與周圍的氧化——還原勢不同而產生。銀染液中的銀離子（Ag+）可與核酸形成穩定的復合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，這樣核酸電泳帶就染成了黑褐色。
3.2 銀染
銀染液的配制：稱2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水
銀染:將電泳完的面板首先在銀染漂洗盆了漂洗趕緊，使膠面上沒有異物。玻璃板反面沒有污染物。
將加入銀染液的銀染盆放在搖床上后，將面板放入銀染1小時左右。
3.3 顯影
顯影液的配制：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml
顯影：將面板從銀染盆里取出，在銀染漂洗盆里漂洗，震蕩5-6次，取出后使其表面盡量無水，再放入已加入顯影液的顯影盆里（顯影，顯影液的配制及甲醛的加入都需要在通風櫥的搖床上進行）顯影過程大約10到15分鐘，以DNA條帶清晰可見為準。
將顯現完畢的板子在顯影漂洗盆里漂洗后，方可讀帶。
本實驗室凝膠電泳相關常用試劑配方：
1. 我實驗室常用的聚丙烯酰胺凝膠是6%變性聚丙烯酰胺凝膠（簡稱變性膠，PAGE），就是在普通聚丙烯酰胺凝膠中加入變性劑。我們使用的變性劑是尿素。
6%PAGE具體配制方法為:
尿素210g，10×TBE 25ml ，丙烯酰胺28.5 g ，亞甲雙丙烯酰胺 1.5g，加水定容至500ml，過濾后使用。
考慮到方便使用的問題，一般一次配制2L（尿素840g，10×TBE100ml，丙烯酰胺114g，亞甲雙丙烯酰胺6g）。
2. 10×TBE（Tris-硼酸-EDTA）的配制
EDTA 7.44g，硼酸55g，Tris 108g，加水定容至1000ml
3. 10%過硫酸氨（AP）
10g過硫酸氨，純水定容至100ml
4. 硅化劑配方
二甲基二氯硅烷：無水乙醇=13ml：500ml
5. 反硅化劑（粘合劑）配制
無水乙醇 500ml（一瓶），44ddH2O，3.3冰醋酸，550ul Bind silnce（3，-Trimethoxysilyl propyl）
配置完遮光4。C保存
6 loading buffer 配制
0.1g 二甲苯氰，0.1g 溴酚藍，1ml 0.5molEDTA ，100mL甲酰胺
以總體積為8ml的5％的濃縮膠為例，
水：5.5ml
30%丙烯酰胺溶液：1.3ml
1.5mol/LTris(pH8.8)：1.0ml
10%SDS：80ul
10%過硫酸氨：80ul
TEMED：6ul
膠不凝或凝得慢，增加過硫酸銨的量到100ul或增加TEMED的量到10ul，不會影響電泳效果。
兩種方法原理不同，有差異是正常的。如果差距較大，要仔細分析。
一般凝膠層析是非變性的，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是變性的，二硫鍵也被還原，所以是亞基（肽鏈）分子量。
聚丙烯酰胺凝膠配方，凝膠層析與分子形狀有關，一般marker都是球狀蛋白，所以測球狀蛋白分子量較準。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與分子形狀無關。
有些蛋白性質特殊，不適于用SDS-凝膠電泳法測定。比如結構特殊的，如膠原；帶很多電荷的，如組蛋白；帶有較大輔基的，如糖蛋白。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的分子量，為什么有時和凝膠層析法所得兩種方法原理不同，有差異是正常的。如果差距較大，要仔細分析。
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