最大的不一樣是聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（PAGE）用的蛋白質(zhì)不做任何變性處置

SDS-PAGE中的SDS是十二烷基磺酸鈉，是蛋白質(zhì)變性劑，SDS能離散蛋白質(zhì)的折疊構(gòu)造，然后沿?cái)U(kuò)展的多肽鏈的外表吸附。使肽鏈帶凈負(fù)電荷，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度僅與蛋白質(zhì)顆粒巨細(xì)有關(guān)。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理是由丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）單體和少數(shù)交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Bis）經(jīng)過(guò)化學(xué)催化劑（過(guò)硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加快劑或光催化聚合效果構(gòu)成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠構(gòu)成網(wǎng)狀構(gòu)造。具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳通常可分紅12～25個(gè)組分。因而適用于不一樣相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的別離，且別離效果好。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,效果：用于別離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。 聚丙烯酰胺凝膠電泳原理:聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀構(gòu)造，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種方式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的進(jìn)程中，蛋白質(zhì)能夠堅(jiān)持完好狀況，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量巨細(xì)、蛋白質(zhì)的形狀及其所順便的電荷量而逐步呈梯度分隔。

而SDS-PAGE僅依據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不一樣就能夠分隔蛋白質(zhì)。該技能開(kāi)端由shapiro于1967年建立，他們發(fā)如今樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中參加離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳搬遷率首要取決于亞基分子量的巨細(xì)（能夠疏忽電荷要素）。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理簡(jiǎn)稱(chēng)為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）  聚丙烯酰氨凝膠電泳，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支撐介質(zhì)的一種常用電泳技能。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合進(jìn)程由自由基催化完結(jié)。催化聚合的常用辦法有兩種：化學(xué)聚合法和光聚合法。化學(xué)聚合以過(guò)硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加快劑。在聚合進(jìn)程中，TEMED催化過(guò)硫酸銨發(fā)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間發(fā)生甲叉鍵交聯(lián)，然后構(gòu)成三維網(wǎng)狀構(gòu)造。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理依據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為接連系統(tǒng)和不接連系統(tǒng)兩大類(lèi)，接連系統(tǒng)電泳系統(tǒng)中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)效果下，首要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不接連系統(tǒng)中因?yàn)榫彌_液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不接連性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不只有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其別離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不接連系統(tǒng)由電極緩沖液、濃縮膠及別離膠所構(gòu)成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HCl。別離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HCl。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖系統(tǒng)、3種pH值使不接連系統(tǒng)構(gòu)成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不接連性，這是樣品濃縮的首要要素。

SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能開(kāi)裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，損壞蛋白分子的二、三級(jí)構(gòu)造。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵開(kāi)裂。在樣品和凝膠中參加還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不一樣分子間的電荷區(qū)別和構(gòu)造區(qū)別。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理通常選用的是不接連緩沖系統(tǒng)，與接連緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。

濃縮膠的效果是有堆積效果，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過(guò)大孔徑凝膠的搬遷效果而被濃縮至一個(gè)狹隘的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開(kāi)端后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少數(shù)的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因而一起向正極移動(dòng)，其間氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開(kāi)端時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，超過(guò)蛋白，因而在后面構(gòu)成低電導(dǎo)區(qū)，而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而發(fā)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子敏捷移動(dòng)，構(gòu)成以安穩(wěn)的界面，使蛋白集合在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。

此鑒定辦法中，蛋白質(zhì)的搬遷率首要取決于它的相對(duì)分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無(wú)關(guān)。

聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

一、意圖需求

（1）學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理原理和技能

（2）學(xué)習(xí)和把握SDS－聚丙烯酰胺凝膠圓盤(pán)電泳別離蛋白質(zhì)技能

二、試驗(yàn)原理

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理是由丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）單體和少數(shù)交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Bis）經(jīng)過(guò)化學(xué)催化劑（過(guò)硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加快劑或光催化聚合效果構(gòu)成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠構(gòu)成網(wǎng)狀構(gòu)造。具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳通常可分紅12～25個(gè)組分。因而適用于不一樣相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的別離，且別離效果好。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理材料的特性

人工合成聚丙烯酰胺凝膠的化學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)成及功用：

Acr：丙烯酰胺

Bis：甲叉雙丙烯酰胺

AP：過(guò)硫酸銨——化學(xué)催化劑

TEMED：四甲基乙二胺——加快劑

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理是一種陰離子去垢劑，SO32-帶負(fù)電荷。在富含強(qiáng)還原劑的SDS溶液中可構(gòu)成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。因?yàn)榻Y(jié)合很多帶負(fù)電荷的聚丙烯酰胺凝膠電泳原理，比如蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣”，蛋白質(zhì)自身帶有的電荷則被掩蓋了。然后起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷區(qū)別的效果。

三、試驗(yàn)材料

（一）試劑

1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 為29:1） 稱(chēng)取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去離子水溶解并稀釋至100ml，貯棕色瓶中于4℃保留，可用一個(gè)月。

2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液  取1mol/L HCL溶液48ml、三羥甲基甲烷（Tris）36.6g，加雙蒸餾水至80ml使其溶解，調(diào)pH至8.8，然后用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃儲(chǔ)存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液  取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加雙蒸餾水至80ml，調(diào)pH6.8，用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃儲(chǔ)存。

4、Tris-甘氨酸電泳緩沖液   稱(chēng)取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸餾水850ml，調(diào)pH至8.3，加蒸餾水到1000ml，4℃儲(chǔ)存。用時(shí)可做10倍稀釋。

5、10% 過(guò)硫酸銨（AP）（6）四甲基乙二胺（TEMED）或β-二甲基氨基丙腈（DMAPN）。

6、10%SDS（十二烷基磺酸鈉） 稱(chēng)取SDS 10g，加蒸餾水100ml使其溶解。

7、四甲基乙二胺（TEMED）

8、上樣緩沖液  取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液6.25ml，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚藍(lán)10ml，加蒸餾水溶解，混合至100ml。

9、考馬斯亮藍(lán)染色試劑  考馬斯亮藍(lán)R250染色液：濃度為2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶蒸餾水=5∶1∶5的溶液制造（V/V）。

10、脫色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸餾水至100ml。

11、樣品：人血清。

12、蛋白質(zhì)分子量象征物  市售中分子量蛋白質(zhì)分子量象征物。也可選擇5種以上的已知分子量蛋白質(zhì)自行制造，留意其分子量散布要能滿(mǎn)足需要，各種蛋白質(zhì)的濃度根本持平。

（二）儀器  圓盤(pán)電泳槽（或垂直板電泳槽）、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀  、脫色搖床。

四、試驗(yàn)辦法

（一）預(yù)備圓盤(pán)電泳槽、電泳儀。

（二）凝膠制備  按下表分別制造別離膠和濃縮膠（此量可供2人用）

別離膠(12%   5ml)        濃縮膠(5%   2ml)

ddH2O        1.6ml        1.4ml

30%混合液        2.0ml        0.33ml

1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl        1.3ml        —

1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl        —        0.25ml

10%SDS        50µl        20µl

10%Ap        50µl        20µl

TEMED        4µl        4µl

留意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后敏捷用滴管灌膠

（三）灌膠

1、先將膠管（5х90mm）封好底，將制造好的別離膠液灌寫(xiě)入膠管內(nèi)，約70mm高度（把握別離膠的高度），在凝膠外表悄悄加一層正丁醇液（約3～4mm）。用于隔絕空氣，使膠面平坦。室溫下靜置約30～60min。調(diào)查膠和正丁醇之間的界面，判別膠是不是凝結(jié)。要在承認(rèn)別離膠完全凝結(jié)后才開(kāi)端制造濃縮膠。

2、別離膠凝結(jié)好后，倒掉掩蓋在別離膠外表的正丁醇，并用去離子水沖刷一次，倒置吸凈殘留的水。將制造好的濃縮膠液灌寫(xiě)入膠管內(nèi)（約15mm），在凝膠外表悄悄加一層正丁醇液（約3～4mm），用于隔絕空氣，使膠面平坦。室溫下靜置約30～60min。調(diào)查膠和正丁醇之間的界面，判別膠是不是凝結(jié)。膠凝結(jié)好后，倒掉掩蓋在膠外表的正丁醇，并用去離子水沖刷一次，倒置吸凈殘留的水，預(yù)備加樣。

（四）樣品預(yù)處置和加樣

1、取血清0.1ml、上樣緩沖液0.9ml，混勻，在沸水中煮沸5min。

2、將膠管封底去掉，放入圓盤(pán)電泳槽中，套緊，不能有空的孔，將Tris-甘氨酸電泳緩沖液參加圓盤(pán)電泳上、下槽中，電泳緩沖液要蓋過(guò)膠管口，然后用微量加樣器（或注射器）將樣品10μl加到膠管膠面內(nèi)。

（五）電泳  上槽接負(fù)極，下槽接正極，先調(diào)電壓為120v/濃縮膠，開(kāi)端電泳，當(dāng)指示染料進(jìn)入別離膠后，將電壓增加到80v/別離膠膠，持續(xù)電泳直至染料抵達(dá)距別離膠下端約1cm處，中止電泳，斷開(kāi)電源。電泳時(shí)刻約1.0~1.5h。

（六）考馬斯亮藍(lán)染色

電泳結(jié)束后，取出電泳膠管，用長(zhǎng)注射器針剝膠，一邊灌水一邊推膠，直至膠出。將膠移至大培養(yǎng)皿中，準(zhǔn)確量取并記載凝膠長(zhǎng)度和指示染料的搬遷間隔（別離膠上緣到染料條帶中間間隔），然后將凝膠板浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中0.5-1h，再用脫色液脫色1~2天，至背景無(wú)色停止。區(qū)帶可作定性或定量剖析。

（七）校正曲線的數(shù)據(jù)處置和分子量測(cè)定  準(zhǔn)確量取并記載染色后凝膠長(zhǎng)度、各象征蛋白質(zhì)和各待測(cè)蛋白質(zhì)區(qū)帶的搬遷間隔（別離膠上緣到各蛋白質(zhì)區(qū)帶中間）。按下式核算各蛋白質(zhì)的相對(duì)搬遷率（Rm值）。

在半對(duì)數(shù)紙上，以各象征蛋白質(zhì)的Rm值為橫坐標(biāo)（一般標(biāo)準(zhǔn)），相應(yīng)的分子量為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)尺刻度）作圖，即得分子量校正曲線。依據(jù)各待測(cè)蛋白質(zhì)的Rm值，查此校正曲線，可求各待測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。

五、留意事項(xiàng)

1．制膠進(jìn)程中用正丁醇封住膠面是為了阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制效果。

2．本法也適合于其他生物樣品中蛋白質(zhì)的剖析。上樣量不宜過(guò)大，不然會(huì)呈現(xiàn)過(guò)載表象。尤其是考馬斯亮藍(lán)R250染色，在蛋白質(zhì)濃度過(guò)高時(shí)，染料與蛋白質(zhì)的氨基(－NH)構(gòu)成的靜電鍵不安穩(wěn)，其結(jié)合不符合Beer規(guī)律，使蛋白質(zhì)量不準(zhǔn)確。

3．Acr和Bis有神經(jīng)毒性，可經(jīng)肌膚、呼吸道等吸收，故操作時(shí)要留意維護(hù)。

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